賽默飛NanoDrop Eight是NanoDrop系列的多通道微量分光光度計,專門用于核酸、蛋白及其他生物樣品的定量分析。與傳統(tǒng)比色皿方式不同,NanoDrop Eight采用微量上樣平臺設計,樣品體積僅需1~2 μL即可完成濃度測定。其優(yōu)勢在于:
高靈敏度與高重復性;
多通道設計,一次可同時檢測多達8個樣品;
無需比色皿和耗材,降低實驗成本;
內置軟件能自動計算濃度并提供純度比值。
NanoDrop Eight覆蓋190~850 nm波長范圍,能夠完成核酸、蛋白、多肽、寡核苷酸以及色素等樣品的快速定量,適合高通量分子生物學實驗室使用。
NanoDrop Eight的核心原理仍然基于比爾-朗伯定律:
A=ε?c?lA = \varepsilon \cdot c \cdot lA=ε?c?l
其中:
AAA 為吸光度(Absorbance);
ε\varepsilonε 為摩爾消光系數(shù);
ccc 為樣品濃度;
lll 為光程。
NanoDrop Eight的特殊之處在于其采用自動調節(jié)光程技術。常見光程為1 mm和0.2 mm,儀器會根據樣品濃度自動切換,以保證結果落在檢測線性范圍內。相比傳統(tǒng)1 cm光程的比色皿,NanoDrop的短光程設計大大拓寬了樣品濃度檢測范圍,可覆蓋0.2~2500 ng/μL的DNA濃度。
打開NanoDrop Eight電源并啟動軟件。
選擇檢測類型(如核酸、蛋白、熒光標記分子等)。
進行光源預熱,確保檢測基線穩(wěn)定。
使用與樣品相同的溶劑(如超純水、TE緩沖液、PBS等)。
在檢測孔中滴加1.5 μL溶劑,點擊“Blank”,完成基線扣除。
將待測樣品1.5 μL加載至檢測孔。
儀器自動檢測光強并調節(jié)光程。
測定完成后,擦拭檢測窗口,避免交叉污染。
軟件界面直接顯示吸光度值、濃度值和純度比值。
支持結果導出為Excel或LIMS數(shù)據庫。
核酸在260 nm處具有最大吸收峰,其濃度可直接通過A260值計算:
dsDNA(雙鏈DNA):1 A260 = 50 ng/μL
ssDNA(單鏈DNA):1 A260 = 33 ng/μL
RNA:1 A260 = 40 ng/μL
寡核苷酸:需根據序列計算摩爾消光系數(shù)
純度判定:
A260/A280 比值:1.8~2.0為純凈核酸,低于此值提示蛋白污染
A260/A230 比值:>2.0為理想值,偏低提示有機溶劑或鹽類殘留
蛋白質在280 nm有特征吸收峰,主要來源于芳香族氨基酸(Trp、Tyr、Phe)。
直接法:A280檢測,需輸入摩爾消光系數(shù)或假設1 A280 = 1 mg/mL(適用于部分蛋白)。
染料法:Bradford法(595 nm)、BCA法(562 nm),通過標準曲線計算濃度。
純度判定:
蛋白樣品常結合光譜掃描確認是否存在核酸或其他色素干擾。
多肽與合成分子:需根據序列或化學結構計算理論消光系數(shù)。
色素與小分子:通過光譜掃描確定最大吸收峰,再建立標準曲線進行濃度換算。
測量波長:260 nm
結果:A260=0.25 → DNA濃度 = 12.5 ng/μL
純度比值:A260/A280=1.85,A260/A230=2.05 → 表明DNA較為純凈,可用于PCR擴增。
測量波長:260 nm
結果:A260=0.4 → RNA濃度 = 16 ng/μL
純度比值:A260/A280=1.95,A260/A230=1.5 → 存在鹽類或酚殘留,需進一步純化。
測量波長:280 nm
結果:A280=0.7,輸入摩爾消光系數(shù)后計算濃度 = 0.9 mg/mL
光譜掃描無核酸污染峰,結果可靠。
濃度結果:NanoDrop軟件直接給出數(shù)值,用戶可導出用于實驗設計。
純度比值:是判定實驗材料是否可用于下游實驗的重要指標。
光譜曲線:通過掃描可發(fā)現(xiàn)異常吸收峰,幫助判斷雜質來源。
批量數(shù)據分析:NanoDrop Eight可同時檢測8個樣品,軟件支持數(shù)據統(tǒng)計與對比。
原因:樣品降解、光程不穩(wěn)定、上樣不足
優(yōu)化:檢查樣品完整性,確保上樣體積準確,使用校正后的移液器
原因:蛋白殘留
優(yōu)化:再次純化樣品,如使用柱式純化或酚氯仿抽提
原因:鹽類或有機物殘留
優(yōu)化:乙醇沉淀或二次洗滌
原因:檢測窗口未清潔,交叉污染
優(yōu)化:每次測量后及時用無絨紙巾擦拭窗口
原因:光程過短仍超范圍
優(yōu)化:稀釋樣品,重新檢測
賽默飛NanoDrop Eight分光光度計憑借微量上樣、多通道并行和自動光程調節(jié)技術,極大地提升了核酸、蛋白及多種生物分子的濃度檢測效率。其結果解讀不僅依賴于吸光度轉化的濃度值,還需要結合純度比值和光譜掃描綜合判斷。
正確的樣品處理、合理的空白校正和規(guī)范的操作步驟,能夠確保實驗結果的準確性與重復性。對于分子生物學研究而言,NanoDrop Eight提供的濃度與純度數(shù)據是后續(xù)PCR擴增、測序、蛋白質表達等實驗能否順利進行的前提保障。
通過科學使用NanoDrop Eight,研究人員能夠在最小樣品消耗的前提下,快速獲得可靠的定量信息,從而大幅度提升實驗室工作效率與研究質量。
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