賽默飛分光光度計 NanoDrop Eight 光譜測定

一、前言

在現(xiàn)代分子生物學(xué)和生命科學(xué)研究中，核酸、蛋白質(zhì)及相關(guān)生物分子的定量和純度分析是實驗的核心環(huán)節(jié)。光譜測定法作為一種無標記、快速的檢測方式，憑借對紫外-可見光波段吸收特性的利用，成為分子檢測的常規(guī)手段。賽默飛 NanoDrop Eight 是一款高通量分光光度計，具備同時檢測八個樣品的能力，在科研與應(yīng)用實驗室中廣泛應(yīng)用。

本文將從 原理、儀器特點、光譜測定流程、應(yīng)用場景、結(jié)果分析、常見問題、與其他方法比較、維護與保養(yǎng) 等方面，全面介紹 NanoDrop Eight 的光譜測定功能。

二、光譜測定原理

1. 基本原理

• 紫外-可見分光光度法利用分子對特定波長光的選擇性吸收來進行定量和定性分析。

• 核酸在 260 nm 處具有強吸收峰，蛋白質(zhì)在 280 nm 處存在芳香族氨基酸的吸收峰。

• 通過測量吸光度（A 值），結(jié)合摩爾消光系數(shù)與比爾-朗伯定律，可以換算分子濃度。

2. 光譜掃描

• NanoDrop Eight 提供 190–850 nm 全波段掃描功能，能夠獲取完整光譜曲線。

• 光譜信息不僅包括定量數(shù)值，還能揭示雜質(zhì)干擾、溶液背景、緩沖液影響。

3. 無比色皿檢測

• 傳統(tǒng)分光光度法需要比色皿，而 NanoDrop Eight 采用光纖與表面張力固定液滴技術(shù)，只需 1–2 μL 樣品即可測定。

三、NanoDrop Eight 儀器特點

1. 高通量

• 八通道同時檢測，適合大批量實驗。

2. 樣品用量小

• 僅需 1–2 μL 樣品，無需稀釋或額外處理。

3. 快速檢測

• 單次測量時間僅數(shù)秒。

4. 數(shù)據(jù)直觀

• 自動輸出吸光度曲線、濃度數(shù)值及純度比值。

5. 多樣化分析模式

• 支持 DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細胞裂解液、環(huán)境樣品等的光譜測定。

四、光譜測定操作流程

1. 開機與系統(tǒng)準備

1. 接通電源，啟動儀器和配套軟件。

2. 等待光源預(yù)熱，確保光學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定。

2. 樣品準備

1. 取 1–2 μL 樣品，避免氣泡產(chǎn)生。

2. 若樣品含有雜質(zhì)，建議離心或過濾。

3. 空白對照設(shè)置

1. 在樣品臺上加入相同緩沖液或溶劑作為 blank。

2. 軟件自動進行基線扣除，校正背景干擾。

4. 樣品檢測

1. 將樣品逐一加入檢測位。

2. 點擊軟件界面“開始測量”。

3. 數(shù)秒后得到完整光譜曲線與濃度結(jié)果。

5. 數(shù)據(jù)導(dǎo)出

1. 結(jié)果可保存為表格或 PDF 格式。

2. 支持批量導(dǎo)出所有通道數(shù)據(jù)。

五、光譜測定的典型應(yīng)用

1. 核酸檢測

• DNA/RNA 定量

• 在 260 nm 吸收峰處測定濃度。

• 自動計算 A260/A280 與 A260/A230，評估蛋白或鹽類污染。

• 應(yīng)用場景

• PCR 擴增前模板濃度測定。

• RNA-Seq 前質(zhì)量控制。

2. 蛋白質(zhì)檢測

• A280 法

• 直接檢測芳香族氨基酸吸收峰。

• 光譜特征

• 280 nm 峰值用于定量，260/280 比值可輔助判斷核酸污染。

• 應(yīng)用場景

• 蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物分析。

• 抗體濃度測定。

3. 酶學(xué)與動力學(xué)研究

• 通過光譜掃描，觀察底物或產(chǎn)物的特征吸收變化。

• 常見波長：405 nm（PNPP 酶底物）、420 nm（ONPG 底物）。

4. 環(huán)境與食品樣品

• 檢測水體中溶解有機物的紫外吸收峰。

• 檢測食品樣品中蛋白、多肽含量。

六、結(jié)果分析與解讀

1. 核酸結(jié)果

• A260/A280 ≈ 1.8：DNA 純度較高。

• A260/A280 ≈ 2.0：RNA 純度較高。

• A260/A230 < 1.8：可能有鹽離子或有機物污染。

2. 蛋白質(zhì)結(jié)果

• A260/A280 ≈ 0.6：較為純凈的蛋白。

• 高于 0.8 可能有核酸殘留。

3. 光譜曲線特征

• 核酸曲線：260 nm 峰明顯。

• 蛋白曲線：280 nm 峰顯著。

• 雜質(zhì)干擾：230 nm、320 nm 處異常吸收。

七、常見問題與解決方案

1. 吸光度過高

• 樣品濃度過高，建議稀釋后重測。

2. 基線不穩(wěn)

• 檢查空白溶液是否與樣品溶劑一致。

3. 重復(fù)性差

• 樣品未充分混勻，或移液操作誤差。

4. 光譜異常峰

• 可能由雜質(zhì)或緩沖液組分引起，應(yīng)優(yōu)化樣品制備。

八、與其他方法的對比

1. 與傳統(tǒng)比色皿分光光度法

• NanoDrop Eight 樣品用量少，操作更快捷。

• 傳統(tǒng)方法適合大體積樣品，高靈敏度時優(yōu)勢明顯。

2. 與熒光定量法

• NanoDrop Eight 操作簡單，適合常規(guī)濃度范圍。

• 熒光法靈敏度更高，適合痕量樣品檢測。

3. 與單通道 NanoDrop One

• Eight 可同時檢測 8 個樣品，效率更高。

• One 適合小規(guī)模實驗室或單樣快速檢測。

九、維護與保養(yǎng)

1. 光源維護

• 定期檢查氘燈與鎢燈壽命，必要時更換。

2. 樣品臺清潔

• 每次檢測后用去離子水和無絨紙擦拭，防止殘留。

3. 環(huán)境管理

• 保持實驗室溫度與濕度穩(wěn)定。

• 避免陽光直射和灰塵。

4. 軟件更新

• 定期檢查升級，保證數(shù)據(jù)處理功能完善。

十、應(yīng)用案例分享

案例一：RNA 質(zhì)量檢測

• 使用 NanoDrop Eight 測定 RNA 樣品，結(jié)果 A260/A280 = 2.01，A260/A230 = 2.05，表明樣品純度良好，可用于轉(zhuǎn)錄組測序。

案例二：質(zhì)粒 DNA 濃度測定

• 測得 A260 = 0.25，對應(yīng)濃度約 125 ng/μL，A260/A280 = 1.82，符合后續(xù) PCR 實驗需求。

案例三：抗體定量

• 在 280 nm 下測得吸光度，計算得抗體濃度 2.5 mg/mL，260/280 = 0.65，說明核酸污染可忽略。

十一、總結(jié)

賽默飛 NanoDrop Eight 的光譜測定功能具有 高通量、低樣品消耗、操作快速、結(jié)果直觀 的優(yōu)勢，能夠高效完成核酸、蛋白及多種生物樣品的定量與純度分析。在科研和應(yīng)用實驗室中，NanoDrop Eight 已成為標準化工具。

在使用過程中，科研人員需要注意：

• 樣品準備是否充分純化，避免雜質(zhì)干擾。

• 合理選擇檢測模式，正確解讀光譜曲線。

• 定期維護與校準，確保儀器長期穩(wěn)定運行。

綜合而言，NanoDrop Eight 的光譜測定不僅在效率和可靠性上優(yōu)于傳統(tǒng)方法，更在高通量實驗環(huán)境中展現(xiàn)出獨特價值，是現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室不可或缺的核心設(shè)備之一。