賽默飛分光光度計NanoDrop Eight蛋白檢測

一、前言

蛋白質(zhì)定量是分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和生物工程領(lǐng)域?qū)嶒灥幕A(chǔ)環(huán)節(jié)。無論是進(jìn)行電泳、免疫印跡，還是進(jìn)行酶學(xué)分析與質(zhì)譜檢測，準(zhǔn)確測定蛋白濃度與純度都是關(guān)鍵步驟。賽默飛NanoDrop Eight分光光度計憑借高通量檢測能力、極低樣品用量及寬廣的光譜范圍，成為實驗室蛋白檢測的常用工具。

本篇將系統(tǒng)介紹NanoDrop Eight在蛋白檢測中的應(yīng)用，從基本原理到操作方法，再到數(shù)據(jù)解讀與實驗經(jīng)驗，全面呈現(xiàn)其優(yōu)勢與實踐要點。

二、蛋白檢測的原理

1. 紫外吸收法

蛋白質(zhì)中含有芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），其在280 nm處有明顯吸收峰。通過測定280 nm處的吸光度即可估算蛋白濃度。該方法簡便快捷，但要求樣品較為純凈，且需預(yù)先知道摩爾消光系數(shù)。

2. 肽鍵吸收法

在190~230 nm區(qū)間，蛋白質(zhì)肽鍵會產(chǎn)生強(qiáng)吸收峰。NanoDrop Eight的光譜范圍覆蓋190 nm，因此可以通過檢測低波長區(qū)域吸收來輔助評估蛋白濃度。

3. 染料結(jié)合法

當(dāng)樣品復(fù)雜、含有雜質(zhì)或緩沖液對280 nm檢測有干擾時，常采用染料法。不同方法的檢測波長如下：

• Bradford法：595 nm

• BCA法：562 nm

• Lowry法：750 nm
  NanoDrop Eight能夠在全光譜范圍內(nèi)檢測，因此適用于上述各種方法。

三、實驗前準(zhǔn)備

1. 儀器準(zhǔn)備

• 將NanoDrop Eight置于穩(wěn)定的實驗臺，避免震動干擾。

• 開機(jī)預(yù)熱3~5分鐘，確保光源穩(wěn)定。

• 檢查檢測平臺，確認(rèn)無殘留或污染。

2. 樣品準(zhǔn)備

• 緩沖液選擇：盡量使用對紫外吸收影響小的緩沖體系，如PBS或Tris。避免高濃度去污劑和有機(jī)溶劑。

• 樣品濃度：保證濃度在儀器的檢測范圍內(nèi)，過高需稀釋，過低可能信噪比不足。

• 混勻處理：確保溶液均一，避免沉淀或氣泡。

3. 空白對照

• 使用與樣品相同的緩沖液作為空白，進(jìn)行基線校正。

• 不同檢測方法需選用相應(yīng)的空白溶液。

四、蛋白檢測的操作步驟

1. 上樣

• 使用移液器準(zhǔn)確取1.5~2 μL樣品，滴加在檢測平臺中央。

• 避免產(chǎn)生氣泡，確保液滴均勻覆蓋光路。

• 關(guān)閉樣品臂，立即開始測定。

2. 模式選擇

• Protein A280模式：快速檢測純蛋白濃度。

• Protein A205模式：基于肽鍵吸收的檢測方法。

• Protein BCA/Bradford模式：適用于復(fù)雜樣品和需要染料的檢測。

• 全光譜掃描：用于評估蛋白樣品的整體吸收特征。

3. 測定流程

• 先測空白對照，建立基線。

• 依次測定各樣品，系統(tǒng)可同時檢測8個通道，提高效率。

• 每次檢測后，儀器會自動輸出濃度、純度及光譜曲線。

五、數(shù)據(jù)解讀

1. A280直接法結(jié)果

• 測得吸光度值后，結(jié)合摩爾消光系數(shù)計算蛋白濃度。

• 該方法適合高純度蛋白樣品，如純化后的重組蛋白。

2. A205法結(jié)果

• 因肽鍵普遍存在，該方法對所有蛋白普適，但背景干擾較大。

• 適用于無法使用A280的樣品。

3. 染料法結(jié)果

• 儀器會根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動換算樣品濃度。

• Bradford法靈敏度較高，適合低濃度蛋白檢測。

• BCA法抗干擾性強(qiáng)，更適合含有去污劑或鹽的樣品。

4. 光譜曲線

• 280 nm處有明顯峰值，說明蛋白濃度較高。

• 230 nm峰值過高可能提示有機(jī)物或緩沖鹽污染。

• 若在260 nm有峰值，需考慮是否存在核酸污染。

六、常見問題與解決方法

1. 吸光度過高

• 原因：蛋白濃度過高，超出檢測范圍。

• 解決：對樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

2. 吸收比值異常

• 問題：蛋白樣品在260 nm處吸收強(qiáng)烈，A260/A280比值過高。

• 原因：核酸污染。

• 解決：對樣品進(jìn)行核酸去除處理。

3. 光譜曲線異常

• 問題：出現(xiàn)鋸齒或噪音過大。

• 原因：樣品體積不足、氣泡或平臺未清潔。

• 解決：重新加樣并清潔平臺。

4. 重復(fù)性差

• 問題：同一樣品多次測定結(jié)果差異大。

• 原因：移液操作不規(guī)范或平臺殘留。

• 解決：保持一致的上樣操作，每次檢測后及時清潔。

七、實驗經(jīng)驗總結(jié)

1. 樣品處理經(jīng)驗

• 蛋白濃度過低時，建議使用Bradford或BCA方法。

• 高鹽或含有還原劑的緩沖液對紫外檢測干擾明顯，應(yīng)提前稀釋或更換緩沖液。

2. 數(shù)據(jù)解讀經(jīng)驗

• 僅依賴280 nm單點結(jié)果可能導(dǎo)致誤差，建議結(jié)合全光譜掃描曲線判斷樣品質(zhì)量。

• 對科研論文或報告，應(yīng)保存完整光譜數(shù)據(jù)，而不僅僅是濃度值。

3. 操作規(guī)范經(jīng)驗

• 樣品體積需嚴(yán)格一致，避免因液滴大小差異導(dǎo)致誤差。

• 建議在實驗室建立統(tǒng)一的SOP流程，尤其是對多用戶實驗室。

4. 高通量檢測經(jīng)驗

• NanoDrop Eight的8通道設(shè)計非常適合批量蛋白檢測，可大幅縮短實驗時間。

• 配合自動化移液器使用時效率更高。

八、維護(hù)與保養(yǎng)

1. 平臺清潔

• 每次檢測后用無核酸酶水或70%乙醇擦拭平臺。

• 避免殘留樣品干固在檢測窗口。

2. 光源檢查

• 長時間使用后若發(fā)現(xiàn)光譜偏移或數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，應(yīng)聯(lián)系廠家維護(hù)。

3. 軟件管理

• 定期更新檢測軟件，保證數(shù)據(jù)處理功能穩(wěn)定。

• 實驗室應(yīng)建立數(shù)據(jù)歸檔制度，統(tǒng)一保存結(jié)果。

九、應(yīng)用案例

1. 蛋白純化后的濃度測定

利用A280法快速檢測目標(biāo)蛋白濃度，結(jié)合純度分析判斷樣品是否可用于下游實驗。

2. 免疫學(xué)實驗準(zhǔn)備

在進(jìn)行ELISA、WB實驗前，使用Bradford法定量蛋白，確保上樣量一致。

3. 酶學(xué)實驗

使用BCA法測定酶蛋白濃度，再配合動力學(xué)實驗評估酶活性。

4. 藥物研發(fā)

檢測重組蛋白或抗體樣品的濃度和純度，保證藥效評價實驗的準(zhǔn)確性。

十、總結(jié)

NanoDrop Eight分光光度計為蛋白檢測提供了快速、準(zhǔn)確、靈敏的解決方案。其優(yōu)勢不僅在于所需樣品體積極少，還在于能同時完成多通道檢測，大幅提升實驗效率。在具體應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)選擇合適的檢測模式，合理解讀光譜數(shù)據(jù)，并保持良好的實驗習(xí)慣。通過積累經(jīng)驗和優(yōu)化流程，研究人員可以更好地發(fā)揮NanoDrop Eight的性能，獲得高質(zhì)量的實驗數(shù)據(jù)。