賽默飛分光光度計 NanoDrop Eight 標準曲線詳解

一、概述

NanoDrop Eight 是賽默飛推出的一款高通量微量分光光度計，能夠在無需比色皿的條件下對核酸、蛋白質(zhì)等生物樣品進行快速準確的定量分析。與傳統(tǒng)單樣測定的分光光度計相比，NanoDrop Eight 支持8個樣品同時測定，顯著提升實驗效率。

在實際應用中，除了直接基于吸光度進行定量，標準曲線法也是 NanoDrop Eight 測定濃度和計算未知樣品的重要方式之一。標準曲線法通過一系列已知濃度的標準樣品測定吸光度值，建立吸光度與濃度之間的數(shù)學關系式，從而用來推算未知樣品的濃度。

標準曲線的應用極其廣泛，涵蓋核酸定量、蛋白質(zhì)測定、酶學反應分析、代謝產(chǎn)物濃度檢測以及藥物制劑質(zhì)量控制等場景。NanoDrop Eight 將標準曲線測定功能與其高通量特點結(jié)合，為科研人員提供了快速、可靠、自動化的數(shù)據(jù)獲取方式。

二、標準曲線的基本原理

標準曲線的構(gòu)建基于比爾-朗伯定律：

$$A=\epsilon ?c?l$$

其中：

• A：吸光度（Absorbance）

• ε：摩爾吸光系數(shù)（Molar absorptivity）

• c：溶液濃度（Concentration）

• l：光程長度（Path length）

在 NanoDrop Eight 中，光程可自動調(diào)節(jié)（0.5 mm 或 1.0 mm），因此在小體積樣品下仍可保證信號的線性。通過在不同濃度下測定吸光度，繪制出濃度-吸光度關系圖，即可得到一條標準曲線。

標準曲線常見的數(shù)學模型包括：

1. 線性回歸模型（最常用）：適用于稀溶液和線性區(qū)間。

2. 二次方程或多項式擬合：用于某些非線性吸收體系。

3. 對數(shù)回歸或指數(shù)回歸：用于酶學反應或動力學實驗。

三、NanoDrop Eight 的標準曲線構(gòu)建流程

1. 樣品準備

• 標準品選擇：應使用純度高、穩(wěn)定性好的已知濃度標準溶液。

• 濃度梯度：通常設置 5–7 個不同濃度點，覆蓋預期樣品濃度范圍。

• 稀釋方式：推薦用相同緩沖液稀釋，避免基質(zhì)效應。

2. 儀器準備

• 打開 NanoDrop Eight，進入軟件界面。

• 選擇“標準曲線模式”。

• 預熱光源，進行基線校正。

3. 數(shù)據(jù)采集

• 在 8 通道采樣臺上加樣，體積僅需 1–2 μL。

• 測定各濃度標準溶液的吸光度。

• 系統(tǒng)自動記錄并生成初步散點圖。

4. 曲線擬合

• 在軟件中選擇擬合模型（如線性回歸）。

• 系統(tǒng)輸出相關系數(shù) R2，判斷擬合優(yōu)度。

• 可進行異常點剔除，確保曲線準確。

5. 樣品測定

• 將未知樣品加載到通道，測得吸光度值。

• 軟件自動代入標準曲線方程，輸出濃度結(jié)果。

四、應用場景

1. 核酸定量

• DNA/RNA 在 260 nm 具有特征吸收峰。

• 使用標準 DNA 溶液（如 λ-DNA）繪制曲線。

• 適用于高通量基因組測序前的樣品質(zhì)量控制。

2. 蛋白質(zhì)測定

• 蛋白質(zhì)在 280 nm 有吸收峰，常用牛血清白蛋白（BSA）作為標準品。

• 也可結(jié)合考馬斯亮藍（Bradford 法）、BCA 法等顯色試劑，選擇 562 nm 或 595 nm 波長。

• NanoDrop Eight 可在同一批次完成多個樣品檢測，顯著提升蛋白定量效率。

3. 酶學反應分析

• 利用酶與底物反應生成有色產(chǎn)物，測定其吸收峰。

• 建立產(chǎn)物濃度與吸光度之間的標準曲線，用于計算酶活。

4. 代謝產(chǎn)物定量

• 各類代謝物如葡萄糖、乳酸等，可通過顯色反應形成吸收峰。

• 標準曲線法可實現(xiàn)批量代謝產(chǎn)物濃度檢測。

5. 藥物與制劑檢測

• 藥物分子在紫外可見光區(qū)常有特征吸收峰。

• 可通過標準曲線測定制劑中有效成分的含量，用于質(zhì)量控制。

五、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果輸出

1. 擬合優(yōu)度評價

• R2 值接近 1.0 表明曲線擬合良好。

• 若擬合效果差，可嘗試更換數(shù)學模型。

2. 誤差與精密度

• 進行平行重復測定，計算標準偏差與相對標準偏差。

• 通過內(nèi)部標準校正可提高結(jié)果可靠性。

3. 結(jié)果可視化

• 軟件可生成濃度-吸光度圖譜。

• 支持光譜曲線疊加，用于樣品之間對比。

4. 報告輸出

• 可直接導出 Excel、PDF 格式，便于保存與共享。

• 報告包含樣品信息、曲線方程、濃度結(jié)果和統(tǒng)計參數(shù)。

六、標準曲線測定中的注意事項

1. 線性范圍

• 測定前應確認樣品濃度在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。

• 若超出范圍需稀釋后再測。

2. 光程自動調(diào)節(jié)

• NanoDrop Eight 會根據(jù)濃度自動切換光程（0.5 mm 或 1.0 mm），避免飽和。

3. 空白校正

• 使用與樣品一致的緩沖液作為空白對照。

• 進行基線扣除，消除背景干擾。

4. 樣品體積控制

• 加樣體積需在 1–2 μL 之間，避免蒸發(fā)或液滴不完整。

5. 數(shù)據(jù)重復性

• 建議每個濃度點做 2–3 次平行測定。

• 排除異常值，確保曲線穩(wěn)定。

七、擴展功能與前景

1. 高通量應用

• 適合基因組學、轉(zhuǎn)錄組學等大規(guī)模樣品測序前的質(zhì)量控制。

2. 軟件集成

• 可與實驗室信息管理系統(tǒng)（LIMS）連接，實現(xiàn)自動化數(shù)據(jù)歸檔。

3. 方法自定義

• 用戶可設定不同波長、不同擬合模型，適配復雜實驗需求。

4. 多組學研究

• 與質(zhì)譜、色譜等手段結(jié)合，標準曲線數(shù)據(jù)可作為定量基礎。

5. 人工智能輔助

• 未來有望通過 AI 自動識別最佳擬合模型，提高數(shù)據(jù)處理效率。

八、總結(jié)

賽默飛 NanoDrop Eight 在標準曲線法的支持下，將微量樣品的定量分析提升到一個新的水平。其優(yōu)勢體現(xiàn)在：

• 高通量：可同時測定 8 個樣品。

• 小體積：僅需 1–2 μL 樣品。

• 高精度：基于自動光程調(diào)節(jié)與精密檢測器，確保結(jié)果準確。

• 智能化：軟件自動繪制標準曲線并輸出濃度結(jié)果。

無論是在核酸、蛋白研究，還是在代謝物檢測、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測中，NanoDrop Eight 的標準曲線功能都能為科研人員和工程技術人員提供可靠、便捷的解決方案，助力實驗室實現(xiàn)高效的數(shù)據(jù)獲取與分析。