伯樂(Bio-Rad)電穿孔儀165-2660是一款高精度的電轉化系統(tǒng),廣泛應用于分子生物學、基因工程、細胞轉染和基因編輯實驗。該設備通過瞬時高壓脈沖在細胞膜上形成可逆性微孔,使外源DNA、RNA或蛋白質進入細胞內部。
在整個實驗體系中,樣品的質量與處理方式是影響電穿孔效果的核心要素之一。即使儀器性能再優(yōu)異,若樣品不符合電轉化要求,也會導致低轉化效率或細胞死亡率升高。因此,在正式操作前,樣品的準備與質量控制至關重要。
伯樂165-2660的設計允許在廣泛的樣品類型下使用,包括細菌、酵母、植物原生質體、哺乳動物細胞、干細胞以及原代組織細胞。不同類型樣品的物理特性、導電性及生理狀態(tài)差異較大,需依據各自特征制定相應的預處理方案。
電穿孔實驗要求細胞處于高活性、對數生長期或生理穩(wěn)定狀態(tài)。
對于細菌和酵母,需確保處于指數生長期,OD600值一般在0.5–0.8之間;
對于真核細胞,應選擇處于生長旺盛、貼壁良好、形態(tài)均一的群體;
原代細胞或干細胞實驗需避免細胞過度分化或凋亡。
細胞活性直接影響膜恢復能力與電穿孔后復蘇效率。若樣品活性下降,將導致電場作用下膜損傷不可逆,實驗失敗率增加。
電穿孔過程中電流需通過樣品液體形成穩(wěn)定電場,因此樣品純度必須高。
污染的離子、蛋白、雜質會改變導電性并導致電弧放電。
所有細胞懸液應使用無離子緩沖液洗滌2–3次;
DNA、RNA樣品需純度高、無蛋白或有機溶劑殘留;
若使用商業(yè)提取試劑,應在最后步驟徹底去除鹽分。
純度不足的樣品容易產生“電弧效應”,不僅損壞電極,也使細胞全部死亡。
適當的細胞濃度有助于形成均勻的電場環(huán)境。濃度過高會造成電阻降低、放電不均;濃度過低則導致轉化效率不足。
一般推薦濃度如下:
| 樣品類型 | 推薦細胞濃度 | 
|---|---|
| 大腸桿菌 | 1×10? cells/mL | 
| 酵母 | 5×10? cells/mL | 
| 哺乳動物細胞 | 1×10? cells/mL | 
| 植物原生質體 | 1×10?–10? cells/mL | 
DNA或RNA加入量通??刂圃跇悠敷w積的1–10%范圍內,濃度建議為10–100 ng/μL。過高濃度會導致黏度增加、局部電場分布不均。
電穿孔要求液體導電性低,以防止能量被離子消耗或引發(fā)電弧。伯樂建議使用專用的無離子電穿孔緩沖液。常用溶液包括:
無鹽HEPES緩沖液;
無離子甘露醇緩沖液;
低離子含量PBS衍生液(需特別去除NaCl)。
導電性理想值應低于 5 μS/cm。若使用水或普通生理鹽水,極易導致高電流和熱損傷。
電穿孔過程中,細胞膜短暫暴露在高電場下,若溶液pH或滲透壓異常,會加劇細胞應激。
pH應維持在7.0–7.4范圍;
滲透壓需接近細胞內環(huán)境,尤其是原生質體與動物細胞,應添加等滲組分(如250 mM蔗糖或甘露醇)。
高滲或低滲環(huán)境均可能導致細胞形態(tài)異常,降低膜修復能力。
低溫有助于減少電穿孔過程中熱效應。實驗前所有緩沖液應預冷至 4°C 左右,但不得凍結。溫度過低會增加液體電阻,而溫度過高會導致膜不可逆破裂。
核酸樣品應具備較高純度,A260/A280比值在1.8–2.0之間。任何鹽離子、乙醇、酚或蛋白殘留都會干擾放電波形。
若使用乙醇沉淀純化的DNA,需徹底干燥殘留乙醇后再溶于無鹽緩沖液中。
濃度建議:
質粒DNA:10–100 ng/μL;
線性DNA:20–200 ng/μL;
mRNA:0.1–1 μg/μL。
質粒或線性DNA分子越大,進入細胞所需電場強度越高。一般情況下,小質粒(<10 kb)電壓1.5–2.0 kV即可,而大分子載體可能需略高電壓或延長脈沖時間。
對于RNA類樣品,應避免長時間暴露空氣,實驗全程保持無RNA酶環(huán)境。
DNA或RNA應溶解于與細胞懸液成分相容的緩沖體系中,避免離子濃度差異導致局部電壓集中。常用溶劑包括無鹽Tris、TE(低離子型)或超純水。
應選用新鮮培養(yǎng)、無污染的菌株;
在冰浴條件下洗滌,使用低導電性溶液(10%甘油或無鹽Tris);
質粒加入量控制在樣品體積的1–2%;
電轉杯需充分預冷,避免局部過熱。
若出現(xiàn)放電火花,說明樣品鹽分過高,應重新洗滌。
酵母細胞壁較厚,需提前酶解或化學預處理以增強膜通透性。常用方法包括β-葡聚糖酶處理或短暫高溫沖擊。
電穿孔時建議使用含蔗糖或山梨醇的滲透緩沖液,保證細胞不因滲透壓差破裂。
樣品溫度應保持在0–4°C,減少熱應激。
哺乳動物細胞對電場極為敏感,要求:
懸浮狀態(tài)均一,無團聚;
緩沖液無鈣鎂離子,導電性低;
樣品體積一般為50–100 μL;
DNA質量高,避免載體內內毒素殘留。
放電結束后,應立即轉入含血清培養(yǎng)基中復蘇,以促進膜修復。
植物原生質體需通過酶解法制備,確保細胞壁完全去除。
懸浮介質含0.5 M甘露醇或蔗糖,維持等滲;
電轉樣品應避免氣泡形成;
電壓0.6–1.0 kV,電容1000 μF,放電時間10 ms左右;
放電后立即在低溫等滲液中靜置數小時以恢復膜完整性。
此類細胞結構脆弱,應嚴格控制電壓與時間常數。
樣品需新鮮分離,避免離心過度;
緩沖液可使用專用電穿孔緩沖體系,維持滲透壓與細胞活性。
RNA或RNP導入實驗中應全程無RNA酶操作,并在冰上快速進行。
電轉杯體積決定電場分布。伯樂165-2660兼容多種電轉杯規(guī)格,常用為0.1 cm、0.2 cm和0.4 cm間隙。
| 電轉杯間隙 | 建議樣品體積 | 適用細胞類型 | 
|---|---|---|
| 0.1 cm | 40–60 μL | 哺乳細胞、小體積樣品 | 
| 0.2 cm | 70–100 μL | 細菌、酵母 | 
| 0.4 cm | 200–400 μL | 原生質體、植物細胞 | 
液體體積過多易產生電流不均,過少則易形成氣泡導致電弧。液面應平整且無氣泡,操作時可輕輕敲擊杯壁排氣。
電極若附著鹽分或蛋白,會增加局部電阻,產生放電異常。實驗前應使用無離子水或70%乙醇清洗杯體,并自然晾干。
杯體表面需保持完好、無劃痕,以防電流集中造成電弧。
溫度直接影響液體電阻與細胞膜穩(wěn)定性。
推薦操作溫度為0–4°C;
樣品應全程置于冰上,但不得凍結;
高溫會加快膜破裂并降低存活率。
實驗結束后,應立即將樣品移入預溫培養(yǎng)基中復蘇,避免因溫差導致細胞應激。
樣品檢測:
在正式電穿孔前,可取少量樣品檢測電導率,理想值為4–6 μS/cm。若過高,應繼續(xù)洗滌。
氣泡檢查:
樣品裝入電轉杯后,仔細觀察是否有氣泡。氣泡是導致放電失敗的主要原因之一。
濃度確認:
若細胞過于密集,可適度稀釋。對于高密度樣品,需避免形成聚團。
質粒測試:
在大規(guī)模轉化前,應以小樣測試質粒質量與濃度,確定最優(yōu)條件。
實驗用樣品應現(xiàn)制現(xiàn)用,不建議長時間儲存。若確需保存:
細胞懸液可在4°C短期存放,不超過2小時;
DNA、RNA樣品可置于-20°C長期保存,但使用前需緩慢解凍并保持無菌環(huán)境;
電轉杯不得重復使用污染樣品,避免交叉反應。
| 問題 | 原因分析 | 解決方案 | 
|---|---|---|
| 放電出現(xiàn)火花 | 緩沖液鹽分高、氣泡存在 | 重新洗滌樣品,排盡氣泡 | 
| 轉化率低 | DNA濃度低、細胞狀態(tài)差 | 提高DNA純度或使用新鮮樣品 | 
| 細胞死亡率高 | 電壓過高、溫度升高 | 降低電壓或預冷操作 | 
| 時間常數異常 | 電阻不穩(wěn)定、液體導電性偏高 | 檢查緩沖液電導率 | 
| 放電無響應 | 電極接觸不良 | 檢查電轉杯與接口是否牢固 | 
伯樂165-2660具備高精度電壓與電容控制系統(tǒng),允許實驗者針對不同樣品進行細致優(yōu)化。優(yōu)化過程可分為以下步驟:
從較低電壓開始逐步提高,觀察時間常數變化;
調整細胞濃度與DNA比例;
記錄每次實驗的溫度、時間常數與復蘇結果;
通過統(tǒng)計分析確定最優(yōu)條件。
建立樣品數據庫后,后續(xù)實驗可快速調用參數,提高效率與重復性。
          
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