本注意事項(xiàng)面向在分子生物學(xué)、細(xì)胞工程、微生物學(xué)與生物醫(yī)藥研發(fā)中使用 GenePulser Xcell 的科研人員與技術(shù)工程師。內(nèi)容覆蓋人員資質(zhì)、環(huán)境與供電、耗材與緩沖液、裝樣操作、脈沖參數(shù)設(shè)定、安全防護(hù)、異常處置、記錄合規(guī)、維護(hù)保養(yǎng)以及典型細(xì)胞場(chǎng)景的專屬要點(diǎn),旨在在確保安全的前提下穩(wěn)定提升實(shí)驗(yàn)成功率與重復(fù)性。
僅限接受過電穿孔原理、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安全互鎖與應(yīng)急處置培訓(xùn)的人員獨(dú)立上機(jī)。
新人上機(jī)需在有經(jīng)驗(yàn)導(dǎo)師的監(jiān)督下完成至少3次完整流程,并通過書面與口頭考核。
了解“電場(chǎng)強(qiáng)度—時(shí)間—細(xì)胞存活率”的平衡關(guān)系,會(huì)用“階梯法”優(yōu)化參數(shù)。
熟悉實(shí)驗(yàn)室EHS規(guī)定:電氣安全、化學(xué)品管理、銳器與高壓操作規(guī)范。
設(shè)備置于干燥、穩(wěn)固、防振的實(shí)驗(yàn)臺(tái),四周留足散熱與操作空間,避免陽光直射與高濕。
供電獨(dú)立回路,可靠接地,建議配隔離穩(wěn)壓/UPS,避免與離心機(jī)、培養(yǎng)箱等大功率設(shè)備共用插座。
相對(duì)濕度≤70%,環(huán)境潔凈,無強(qiáng)電磁干擾;附近嚴(yán)禁堆放導(dǎo)電液體或金屬器具。
桌面保持整潔,電纜走線固定,避免人員絆倒與拉扯接口。
開箱/年度驗(yàn)收:核對(duì)序列號(hào)、附件與模塊一致,通電自檢無報(bào)錯(cuò),ShockPod 上蓋安全開關(guān)靈敏。
例行點(diǎn)檢(每周/每臺(tái)):外觀、接口、風(fēng)扇、顯示、按鍵、比色皿槽、觸點(diǎn)清潔度。
輸出核查(每月):用標(biāo)準(zhǔn)負(fù)載或參考樣測(cè)試電壓偏差、時(shí)間讀數(shù)一致性;出現(xiàn)漂移須登記并復(fù)測(cè)。
校準(zhǔn)周期:按照實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系(如GxP/ISO)執(zhí)行,保存校準(zhǔn)報(bào)告與證書。
比色皿間隙與樣品類型匹配:0.1 cm(細(xì)菌/小體積/高場(chǎng)強(qiáng))、0.2 cm(酵母/真菌)、0.4 cm(哺乳動(dòng)物/敏感細(xì)胞)。
嚴(yán)格區(qū)分一次性與可重復(fù)比色皿:一次性用后棄;可重復(fù)型號(hào)按規(guī)范清洗、烘干與編號(hào)。
使用原配或等規(guī)格高純電極與ShockPod配件;電極表面必須平整、無氧化斑。
槍頭、離心管、濾膜等與電穿孔緩沖體系相容,避免釋放微量離子或增塑劑。
低導(dǎo)電、低鹽策略:避免PBS、含高鹽培養(yǎng)基;優(yōu)先使用專用電穿孔緩沖液或等滲低離子體系。
pH與滲透壓穩(wěn)定:pH漂移會(huì)影響膜電位;等滲保護(hù)劑(如山梨醇/甘露醇)可顯著提高敏感細(xì)胞存活率。
核酸質(zhì)量:高純、無鹽、無蛋白、無溶劑殘留;超螺旋質(zhì)粒較線性DNA更容易進(jìn)入細(xì)胞。
預(yù)冷策略:比色皿、緩沖液與細(xì)胞懸液4 ℃預(yù)冷以減輕熱效應(yīng)與電弧風(fēng)險(xiǎn)。
細(xì)胞狀態(tài):對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活力高、無污染;哺乳動(dòng)物細(xì)胞避免過度融合或營(yíng)養(yǎng)匱乏狀態(tài)。
緩慢沿比色皿壁加樣,使液面平齊電極下緣,不得超過標(biāo)稱體積的90%。
觀察并消除氣泡:輕敲比色皿側(cè)壁或緩慢回抽再注入;切勿用力吹打造成二次起泡。
保持電極/觸點(diǎn)干燥潔凈:外壁若有液滴立即拭凈,防止外部漏電或虛接。
比色皿須穩(wěn)固插入ShockPod底座,確認(rèn)定位槽貼合、上蓋一次閉合到位。
原則:先?;?,再提效;先低后高、單因子遞進(jìn)微調(diào)。
電壓(V):隨間隙(d)線性折算電場(chǎng)E=V/d。初次建議從廠家/文獻(xiàn)中位值—10%起步。
脈沖時(shí)間/時(shí)間常數(shù):方波以5–20 ms為常見起點(diǎn)(哺乳動(dòng)物);指數(shù)衰減觀察τ(3–5 ms常見),τ過短穿孔不足,過長(zhǎng)熱損傷增大。
電容/并聯(lián)電阻:電容決定能量與波尾;并聯(lián)電阻抑制過流與電弧,低電阻≠高成功率。
脈沖數(shù)與間隔:1→2→3階梯增加;間隔≥0.5–1 s,確保膜局部修復(fù)與散熱。
樣品電阻監(jiān)測(cè):放電前/后比對(duì);異常偏低提示鹽/滲漏/沾濕,必須停機(jī)排查。
不同間隙切換時(shí),同步按比例更改電壓,切勿直接套用舊參數(shù)。
放電前最后一次“目視確認(rèn)”:蓋子閉合、安全鎖指示正常、界面參數(shù)核對(duì)無誤。
放電中嚴(yán)禁觸碰ShockPod與導(dǎo)線,禁止開啟上蓋或移動(dòng)比色皿。
如聞異味、見火花、界面報(bào)警或聽到“噼啪”異常聲,立即急停、斷電并記錄。
工作臺(tái)上不得有大量酒精或易燃溶劑;使用有機(jī)溶劑時(shí)注意通風(fēng)與靜電控制。
操作者佩戴防護(hù)眼鏡與實(shí)驗(yàn)手套;濕手不得觸碰設(shè)備。
預(yù)防:低鹽、除氣泡、潔凈電極、干燥外壁、穩(wěn)固接觸、合理電壓與時(shí)間。
處置:
發(fā)生電弧后終止本次序列;取出比色皿檢查有無焦痕與裂紋。
清潔ShockPod觸點(diǎn);復(fù)查緩沖體系與加樣體積,必要時(shí)更換新比色皿與緩沖液。
降低電壓或縮短脈沖時(shí)間,再次試驗(yàn)前做空載或標(biāo)準(zhǔn)樣自檢。
軟報(bào)錯(cuò):記錄錯(cuò)誤代碼→返回主界面→斷電1–2分鐘→復(fù)位上電→空載自檢→再上樣。
硬故障(異味/異常熱/黑屏):立即斷電并張貼“停用”標(biāo)識(shí),通知工程支持;禁止帶病運(yùn)行。
連續(xù)三次異常:暫停當(dāng)日實(shí)驗(yàn),執(zhí)行“5點(diǎn)排查”——供電、觸點(diǎn)潔凈、比色皿、緩沖體系、參數(shù)邊界。
迅速轉(zhuǎn)入等滲復(fù)蘇體系:哺乳動(dòng)物細(xì)胞加入含血清預(yù)溫培養(yǎng)基靜置5–10 min;細(xì)菌加入SOC/SOB 30–60 min復(fù)蘇;酵母注意滲透壓維持。
電擊后短時(shí)間內(nèi)避免劇烈離心與頻繁換液,降低膜二次損傷風(fēng)險(xiǎn)。
設(shè)置“陰性/空載/載體對(duì)照”,區(qū)分設(shè)備與生物學(xué)因素。
記錄原則:ALCOA+(可歸屬、清晰、同步、原始、準(zhǔn)確、持久、完整、一致、可用)。
每次實(shí)驗(yàn)至少記錄:日期/人員/細(xì)胞批次/比色皿間隙/緩沖配方與批號(hào)/加樣體積/預(yù)冷情況/設(shè)定與實(shí)測(cè)參數(shù)(電壓、電流、τ或脈沖時(shí)間)/異常與處置/結(jié)果指標(biāo)。
建立“最佳參數(shù)庫”,對(duì)不同細(xì)胞系與用途形成版本化SOP,限制隨意改動(dòng)。
結(jié)束當(dāng)日:外殼與ShockPod表面擦拭;觸點(diǎn)用去離子水+無絨巾清潔并自然干燥。
每20–30次深度清潔:輕度酒精擦拭去污、徹底漂洗去離子水、完全干燥再收納。
每月:檢查風(fēng)道與散熱;核對(duì)接口、線纜與上蓋鎖扣磨損。
半年:輸出一致性復(fù)核;必要時(shí)做專業(yè)校準(zhǔn)與內(nèi)部除塵。
停機(jī)存放:干燥劑、防塵罩、遠(yuǎn)離腐蝕性氣體;定期上電自檢防止電容長(zhǎng)期閑置劣化。
1)哺乳動(dòng)物細(xì)胞
方波優(yōu)先;10–20 ms、1–2脈沖起步;細(xì)胞密度與活力決定上限。
貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)懸必須溫和;電擊后盡快回溫復(fù)蘇。
質(zhì)粒體積盡量小、純度高;含血清的殘留要徹底去除再電擊。
2)細(xì)菌
0.1 cm間隙,高場(chǎng)強(qiáng)指數(shù)衰減;細(xì)胞反復(fù)低鹽洗滌,徹底去離子。
質(zhì)粒鹽分殘留會(huì)直接誘發(fā)電弧,必要時(shí)再純化。
電擊后復(fù)蘇充分,再涂板;過早選擇性壓力會(huì)壓低效率。
3)酵母/真菌
維持滲透壓(山梨醇/甘露醇);可配合細(xì)胞壁酶預(yù)處理。
脈沖能量寧穩(wěn)不猛,多脈沖間隔要足夠。
4)植物原生質(zhì)體
高滲緩沖與抗氧化劑保護(hù);裝樣輕柔,避免剪切損傷。
適度延長(zhǎng)方波時(shí)間,但必須控制熱效應(yīng)。
5)CRISPR體系
RNP較質(zhì)粒更敏感:低溫短時(shí)策略;核酸/蛋白摩爾比優(yōu)化先于提高場(chǎng)強(qiáng)。
嚴(yán)控?zé)o菌與內(nèi)毒素水平,減少應(yīng)激反應(yīng)。
?;铍A:固定低電容/短時(shí)單脈沖,逐步加電壓,監(jiān)控活率≥80%。
提效階:在活率穩(wěn)定前提下,微調(diào)脈沖時(shí)間或加第2脈沖,觀察陽性率提升斜率。
穩(wěn)態(tài)階:小范圍往返微調(diào),鎖定“效率—活率—成本”的綜合最優(yōu)點(diǎn),并固化為SOP與模板程序。
杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司