本儀器基于電穿孔原理,通過(guò)在短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品施加高壓脈沖,使細(xì)胞膜形成瞬時(shí)微孔,從而允許外源 DNA、RNA、蛋白質(zhì)或納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。165-2661 型在結(jié)構(gòu)、控制、數(shù)據(jù)記錄等方面具有高精度、可重復(fù)性和綜合安全保障。
實(shí)驗(yàn)步驟可細(xì)分為:樣品準(zhǔn)備、儀器設(shè)置、電擊執(zhí)行、樣品回收與培養(yǎng)、結(jié)果評(píng)估。每一環(huán)節(jié)均有其關(guān)鍵要點(diǎn)和注意事項(xiàng)。
將儀器安放于平整、干燥、無(wú)強(qiáng)振動(dòng)、無(wú)直射陽(yáng)光的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。
接通電源,確認(rèn) AC 220 V ± 10%,50/60 Hz,且插座已接地。
開機(jī)后儀器進(jìn)行自檢,確認(rèn)蓋鎖檢測(cè)、溫度傳感、自動(dòng)放電系統(tǒng)、風(fēng)扇散熱系統(tǒng)均正常。
檢查電擊槽(ShockPod)內(nèi)部是否干燥、無(wú)殘液、無(wú)沉淀物。電擊杯是否清潔、干燥、無(wú)裂紋或氧化。
準(zhǔn)備電擊杯、緩沖液、樣品、外源分子、刻度移液器等。確保所有耗材無(wú)鹽、無(wú)離子強(qiáng)度過(guò)高。
預(yù)設(shè)培養(yǎng)環(huán)境。若用哺乳動(dòng)物細(xì)胞,預(yù)熱培養(yǎng)基至 37 ℃;若用細(xì)菌或酵母,準(zhǔn)備適宜轉(zhuǎn)化/培養(yǎng)平板。
從周期培養(yǎng)或適宜狀態(tài)下取細(xì)胞:細(xì)菌為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,酵母或真核細(xì)胞亦處于對(duì)數(shù)期。
離心、洗滌多次以去除培養(yǎng)基中高鹽成分,使用低離子緩沖液或純水重懸。
樣品濃度調(diào)整至推薦范圍:例如細(xì)菌約 1×10? cells/mL,真核細(xì)胞約 1×10?–1×10? cells/mL。
外源分子(DNA、RNA、蛋白)應(yīng)純度高、無(wú)鹽,并緩慢加入樣品中,輕柔混勻。
將混合樣品置于冰上或低溫條件(通常 0-4 ℃)預(yù)冷 5-10 分鐘,以減少熱效應(yīng)。
移液至電擊杯,體積一般為電擊杯最大容積的 60-80%。避免液面高于電極上緣或產(chǎn)生氣泡。
在主界面按“MENU(菜單)”鍵進(jìn)入設(shè)置模塊。
選擇“Manual Setup(手動(dòng)設(shè)置)”或“Preset Protocol(預(yù)設(shè)方案)”視實(shí)驗(yàn)需要。
以下是常規(guī)需設(shè)定的參數(shù):
電壓 (Voltage):例如 400-700 V(真核細(xì)胞)、1200-1600 V(酵母)、2000-2500 V(細(xì)菌)等。
電容 (Capacitance):例如 25-500 μF 細(xì)菌體系、小電容;500-1000 μF 真核或植物體系。
電阻 (Resistance):根據(jù)樣品電導(dǎo)率設(shè)定,一般 50-600 Ω。如儀器具自動(dòng)匹配 “Auto-R” 選項(xiàng)可啟用。
波形類型 (Waveform):選擇指數(shù)衰減波(Exponential)或方波(Square)模式,依據(jù)細(xì)胞類型與目的。
脈沖次數(shù) (Pulse Count):可設(shè) 1-10 次。敏感細(xì)胞可用多脈沖,耐受細(xì)胞可用單脈沖。
間隔時(shí)間 (Pulse Interval):多次脈沖間隔建議 0.5-2 s,視樣品耐受性而定。
保存參數(shù)方案:完成設(shè)定后按 “SAVE” 鍵保存當(dāng)前參數(shù)組,以便日后調(diào)用。
檢查設(shè)定的電壓是否在儀器允許范圍(10-3500 V)內(nèi)。
檢查電容與電阻組合是否合理,確保時(shí)間常數(shù)(τ = R × C)在適用范圍。
確認(rèn)電擊杯間隙、樣品體積、電導(dǎo)率等與設(shè)置參數(shù)匹配。
若使用梯度模式(Gradient Mode),設(shè)定起始電壓、步長(zhǎng)、次數(shù)。
將預(yù)冷樣品轉(zhuǎn)移到電擊杯中,確認(rèn)無(wú)氣泡。
蓋上杯蓋并插入 ShockPod。
蓋鎖應(yīng)聽“咔噠”聲提示閉合成功,儀器顯示 “LID CLOSED – SAFE TO RUN”。
按 “PULSE” 鍵進(jìn)入充電狀態(tài),儀器提示 “READY TO PULSE”。
按 “ENTER” 鍵執(zhí)行放電。
放電過(guò)程中,儀器自動(dòng)顯示實(shí)際輸出電壓、時(shí)間常數(shù)、能量釋放比例等數(shù)據(jù)。
放電結(jié)束后,屏幕提示 “COMPLETE”,系統(tǒng)進(jìn)入冷卻或退出狀態(tài)。
放電結(jié)束后 5-10 秒再打開蓋子,避免電弧殘留。
將樣品立即轉(zhuǎn)入預(yù)熱培養(yǎng)基或平板中,輕輕混勻。
細(xì)菌樣品可立即置于適溫培養(yǎng),哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)至 37 ℃ CO? 培養(yǎng)箱恢復(fù)。
記錄本次放電參數(shù)、樣品類型、體積、濃度、結(jié)果編號(hào)等,用于后續(xù)分析。
放電后立即加入適量預(yù)溫培養(yǎng)液(如 SOC、YPD 等),輕輕混勻。
在 37 ℃(細(xì)菌)或 30 ℃(酵母)溫育約 30-60 分鐘以允許細(xì)胞修復(fù)。
將適量樣品鋪平至選擇性培養(yǎng)平板,培養(yǎng)至菌落形成。
放電后轉(zhuǎn)入含血清完全培養(yǎng)基,置于 37 ℃、5% CO? 條件培養(yǎng)。
靜置 1-2 小時(shí)后可換培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間點(diǎn)。
后續(xù)可進(jìn)行熒光標(biāo)記、Western blot、流式檢測(cè)等分析。
轉(zhuǎn)入含甘露醇保護(hù)劑或適用于原生質(zhì)體的培養(yǎng)液中恢復(fù)。
置于 25-28 ℃ 溫和光照條件下,時(shí)間約 1-2 小時(shí)。
后續(xù)用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)、熒光觀察或下游分析。
儀器自動(dòng)保存:實(shí)際輸出電壓、電阻、時(shí)間常數(shù)、能量釋放比例、波形圖。
可通過(guò) USB 導(dǎo)出 CSV 或 TXT 文件,用于統(tǒng)計(jì)分析。
轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染效率:細(xì)菌以 CFU/μg DNA 表示;真核細(xì)胞以陽(yáng)性細(xì)胞占比表示。
細(xì)胞存活率:通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)、PI 染色或流式計(jì)數(shù)評(píng)估。
表達(dá)水平:如熒光蛋白表達(dá)、qPCR 或 Western blot 檢測(cè)。
重復(fù)性與穩(wěn)定性:三次以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)波動(dòng)較?。ɡ缧首兓?<±15%)。
整理不同參數(shù)組合與實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)應(yīng)關(guān)系。
繪制轉(zhuǎn)化效率-電壓、時(shí)間常數(shù)-存活率等曲線。
根據(jù)趨勢(shì)調(diào)整參數(shù),進(jìn)入下一輪優(yōu)化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后關(guān)閉電源。
等待 10 秒自動(dòng)放電后再打開蓋子。
用無(wú)水乙醇擦拭電擊杯、電極及 ShockPod 內(nèi)部,確保干燥。
清理通風(fēng)口和風(fēng)扇濾網(wǎng),保持散熱通暢。
定期(每月/每季度)校驗(yàn)輸出電壓、時(shí)間常數(shù)與波形穩(wěn)定性。
電擊前必須確認(rèn)蓋鎖閉合,嚴(yán)禁操作中觸摸電極。
樣品緩沖液不得含高鹽或氣泡,避免電弧發(fā)生。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)佩戴絕緣手套。若出現(xiàn)閃光、冒煙、異常聲音,立即斷電。
實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)遠(yuǎn)離液體、金屬器具或未經(jīng)接地的物體。
操作后樣品應(yīng)及時(shí)回收并對(duì)廢液做高壓滅菌處理。
檢查儀器與環(huán)境;
準(zhǔn)備樣品(濃度、電導(dǎo)率、體積);
設(shè)定儀器參數(shù)(電壓、電容、電阻、波形、脈沖次數(shù));
裝載電擊杯,檢測(cè)蓋鎖狀態(tài);
執(zhí)行放電;
樣品轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)條件;
記錄數(shù)據(jù)與結(jié)果;
清理儀器,維護(hù)設(shè)備。
          
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