伯樂(Bio-Rad)電穿孔儀165-2661是一款專業(yè)的高壓脈沖電轉(zhuǎn)化儀,專為基因?qū)?、?xì)胞電轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)而設(shè)計(jì)。該設(shè)備通過瞬時(shí)高壓脈沖在細(xì)胞膜上形成可逆性孔洞,使外源DNA、RNA或其他帶電分子穿過細(xì)胞膜,從而實(shí)現(xiàn)高效導(dǎo)入。
165-2661作為伯樂電穿孔儀系列的改進(jìn)型號(hào),在電壓精度、能量釋放速度、放電穩(wěn)定性以及電弧防護(hù)系統(tǒng)方面均有顯著提升。其操作系統(tǒng)采用數(shù)字化控制面板,可自動(dòng)計(jì)算時(shí)間常數(shù)(τ),并具備多組參數(shù)存儲(chǔ)功能,便于用戶快速調(diào)用常用實(shí)驗(yàn)設(shè)置。
本文將對(duì)165-2661的操作步驟、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、放電執(zhí)行流程、安全管理及數(shù)據(jù)記錄方法進(jìn)行系統(tǒng)闡述,以指導(dǎo)科研人員在操作中實(shí)現(xiàn)高重復(fù)性、高效率與安全性的統(tǒng)一。
實(shí)驗(yàn)室溫度:20–25°C;
相對(duì)濕度:≤60%;
電源規(guī)格:AC 220 V ±10%,50/60 Hz;
接地電阻:≤1 Ω;
環(huán)境條件:無強(qiáng)磁場(chǎng)干擾、無高濕、無導(dǎo)電塵埃;
通風(fēng)要求:儀器背部至少保持30 cm的散熱間距。
在開機(jī)前必須完成以下自檢:
檢查電源線是否完好并確認(rèn)接地端連接正確;
檢查電極接口、輸出端無污漬與腐蝕;
確認(rèn)安全蓋感應(yīng)系統(tǒng)靈敏;
清潔電轉(zhuǎn)杯與支架,避免殘留鹽分或水分;
檢查主機(jī)顯示屏能正常亮起,鍵盤操作響應(yīng)靈敏。
如設(shè)備自檢失敗或出現(xiàn)“Check System”提示,應(yīng)停止使用并聯(lián)系維護(hù)人員。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象不同,細(xì)胞制備方式略有差異。以下以常見的大腸桿菌和哺乳細(xì)胞為例:
細(xì)菌(如E. coli DH5α)
取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37°C、220 rpm培養(yǎng)過夜;
將1 mL菌液接種入100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD???≈0.4;
離心收集菌體(4000 rpm,4°C,5分鐘);
使用冰冷10%甘油溶液洗滌3次,去除培養(yǎng)基鹽分;
重懸于10%甘油溶液中,濃度約1×10? cells/mL;
4°C保存,24小時(shí)內(nèi)使用。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO或HeLa)
使用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞,收集并離心;
重懸于無血清緩沖液或電穿孔專用緩沖液中;
調(diào)整濃度至2×10? cells/mL;
保持低溫備用(4°C)。
將外源DNA或RNA溶液(通常為1–2 μg)加入感受態(tài)細(xì)胞中;
混合均勻后置于冰上預(yù)冷3–5分鐘;
檢查液體是否無氣泡,避免放電時(shí)產(chǎn)生電弧。
選擇合適間隙的電轉(zhuǎn)杯(0.1、0.2或0.4 cm);
使用無菌純水清洗并風(fēng)干;
放入冰上預(yù)冷10分鐘后使用。
165-2661的數(shù)字化面板可實(shí)現(xiàn)高精度參數(shù)設(shè)定。以下為詳細(xì)設(shè)置流程:
電壓設(shè)定(Voltage)
按下“VOLTAGE”鍵進(jìn)入電壓設(shè)定界面;
使用方向鍵輸入所需電壓(范圍0.2–2.5 kV);
按“ENTER”確認(rèn)。
電容設(shè)定(Capacitance)
按“CAP”鍵選擇電容檔位;
可調(diào)范圍:25、50、125、250、500、1000、3300 μF;
系統(tǒng)自動(dòng)切換儲(chǔ)能單元并顯示實(shí)際值。
電阻選擇(Resistance)
默認(rèn)固定電阻200 Ω;
特殊實(shí)驗(yàn)可啟用外接電阻模塊(選配)。
模式選擇(Mode)
單脈沖模式:適合細(xì)菌、酵母等;
多脈沖模式:適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞;
程序模式:保存常用參數(shù),快速調(diào)用。
安全檢測(cè)確認(rèn)
設(shè)備自動(dòng)檢測(cè)電極接觸、電源接地及安全蓋狀態(tài);
顯示“Ready to Pulse”后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
吸取40–50 μL細(xì)胞混合液加入電轉(zhuǎn)杯;
確保液面均勻覆蓋電極表面;
輕拍電轉(zhuǎn)杯底部,排出微小氣泡;
插入電擊槽,確保電極完全接觸。
關(guān)閉安全蓋;
按下“PULSE”鍵;
系統(tǒng)瞬時(shí)釋放儲(chǔ)能電量并開始放電;
顯示屏實(shí)時(shí)顯示放電電壓、時(shí)間常數(shù)(τ)及狀態(tài)信息;
放電完成后屏幕顯示“Pulse Complete”。
正常放電:顯示“OK”,時(shí)間常數(shù)為穩(wěn)定衰減曲線(如4.8 ms);
電弧放電:顯示“ARC DETECTED”,表示樣品導(dǎo)電性過高或存在氣泡;
放電中斷:顯示“ABORTED”,通常由安全蓋打開或接地異常引起。
如檢測(cè)到異常,應(yīng)立即停止操作,重新制備樣品或檢查電轉(zhuǎn)杯。
樣品冷卻
放電后立即取出電轉(zhuǎn)杯并置于冰上1–2分鐘,防止熱效應(yīng)損傷細(xì)胞。
復(fù)蘇與培養(yǎng)
向電轉(zhuǎn)杯中加入1 mL冰冷SOC或無血清培養(yǎng)基;
輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至離心管;
在37°C下復(fù)蘇60分鐘(細(xì)菌)或在37°C、5% CO?條件下復(fù)蘇4小時(shí)(哺乳細(xì)胞)。
篩選培養(yǎng)
涂布含抗生素的平板(對(duì)細(xì)菌);
接種入選擇性培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系(對(duì)真核細(xì)胞);
培養(yǎng)12–24小時(shí)后觀察結(jié)果。
伯樂165-2661具備數(shù)據(jù)存儲(chǔ)與導(dǎo)出功能。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)記錄以下信息:
| 項(xiàng)目 | 參數(shù)值 | 備注 | 
|---|---|---|
| 電壓 | 2.5 kV | 設(shè)定值 | 
| 電容 | 25 μF | 檔位2 | 
| 電極間隙 | 0.2 cm | 標(biāo)準(zhǔn)杯 | 
| 時(shí)間常數(shù) | 4.8 ms | 實(shí)測(cè)值 | 
| 電弧狀態(tài) | 無 | 正常放電 | 
| 樣品溫度 | 4°C | 冰浴條件 | 
| 轉(zhuǎn)化效率 | 9.8×10? CFU/μg DNA | 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 | 
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可通過USB接口導(dǎo)出至電腦進(jìn)行存檔與分析。
高壓防護(hù)
嚴(yán)禁在安全蓋打開時(shí)放電;
操作時(shí)手部不得接觸電極區(qū)域;
每次放電后等待5秒再取樣,防止殘余電荷。
樣品安全
使用低導(dǎo)電緩沖液,避免電弧損壞;
禁止含鹽PBS或NaCl溶液進(jìn)入電轉(zhuǎn)杯;
每次實(shí)驗(yàn)后清洗電極,防止鹽沉積。
環(huán)境防護(hù)
保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)干燥,防止漏電;
遠(yuǎn)離磁性設(shè)備與熱源;
放電時(shí)避免他人靠近。
異常處理
若設(shè)備報(bào)警或屏幕閃爍異常,應(yīng)立即斷電;
檢查高壓電纜連接與接地狀態(tài),確認(rèn)無異常后再重新啟動(dòng)。
為確保重復(fù)性與安全性,建議建立以下標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP):
開機(jī)前檢查表
電源與接地是否正常;
電極與電轉(zhuǎn)杯是否干凈;
溫度與濕度是否達(dá)標(biāo)。
參數(shù)記錄模板
每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)完整記錄電壓、電容、時(shí)間常數(shù)、溫度及電弧狀態(tài)。
重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
同一條件下連續(xù)放電10次,若時(shí)間常數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.2 ms,則系統(tǒng)穩(wěn)定。
月度維護(hù)
清潔電極接口;
檢查風(fēng)扇與散熱系統(tǒng);
驗(yàn)證電壓輸出精度(偏差≤1%)。
| 問題 | 原因分析 | 解決方案 | 
|---|---|---|
| 電弧頻繁 | 樣品電導(dǎo)率過高或有氣泡 | 使用低離子緩沖液并排氣泡 | 
| 時(shí)間常數(shù)偏低 | 電阻下降或電極污染 | 清潔電極并更換緩沖液 | 
| 放電不啟動(dòng) | 安全蓋未關(guān)閉或接地異常 | 檢查安全鎖和電源線 | 
| 樣品加熱嚴(yán)重 | 能量過大或復(fù)蘇延遲 | 降低電壓并立即冰浴 | 
| 無菌落生長(zhǎng) | DNA質(zhì)量低或細(xì)胞損傷 | 優(yōu)化DNA純度并調(diào)整能量 | 
優(yōu)化電壓與電容比例
電壓決定電場(chǎng)強(qiáng)度,電容影響能量持續(xù)時(shí)間。
細(xì)菌推薦2.5 kV/25 μF;哺乳細(xì)胞推薦0.4–0.8 kV/250 μF。
控制時(shí)間常數(shù)
理想時(shí)間常數(shù)應(yīng)保持在4–10 ms之間。
過短導(dǎo)致導(dǎo)入不完全,過長(zhǎng)增加熱損傷。
緩沖液優(yōu)化
使用電導(dǎo)率≤10 μS/cm的低離子緩沖體系;
推薦使用10%甘油、HEPES或Tris衍生緩沖液。
樣品體積與間隙匹配
確保液體完全覆蓋電極表面;
間隙過大或體積不足均會(huì)影響電場(chǎng)均勻性。
以大腸桿菌DH5α為模型的電穿孔實(shí)例:
電壓:2.5 kV
電容:25 μF
電轉(zhuǎn)杯間隙:0.2 cm
樣品體積:50 μL
時(shí)間常數(shù):4.8 ms
結(jié)果:獲得穩(wěn)定菌落,轉(zhuǎn)化效率9.6×10? CFU/μg DNA。
此條件下能量釋放平穩(wěn),細(xì)胞活性高,證明儀器性能可靠。
          
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