GenePulser Xcell 是一款模塊化電穿孔系統(tǒng)。它包括主機單元(main unit)、ShockPod? 電擊腔(cuvette chamber)、以及可選的兩個附件模塊:CE 模塊(Capacitance Extender)用于擴展電容/時間常數(shù)范圍;PC 模塊(Pulse Controller)用于擴展電阻(并聯(lián)電阻)控制。
系統(tǒng)支持兩種主要波形:指數(shù)衰減(exponential-decay)波形和方波(square-wave)波形。
其設(shè)計目標(biāo)是:適用于大范圍細(xì)胞類型—from 哺乳動物細(xì)胞(包括原代細(xì)胞、難轉(zhuǎn)染細(xì)胞)到細(xì)菌、酵母、真菌。
儀器具備預(yù)設(shè)程序庫、用戶自定義程序、手動參數(shù)輸入三種模式,便于快速啟動或細(xì)致優(yōu)化。
此外,系統(tǒng)內(nèi)置了 PulseTrac? 電路與電弧保護(hù)等功能,以提高重復(fù)性并降低樣品風(fēng)險。
此類波形通過電容快速充電,當(dāng)擊穿或放電啟動后,電壓隨時間按指數(shù)形式下降。適用于很多標(biāo)準(zhǔn)電穿孔條件。用戶可設(shè)定電容(μF)、電壓(V)和(在某版本)時間常數(shù)(τ)或電阻。
優(yōu)點包括:電壓開始時高峰,有利于在短時間內(nèi)打開細(xì)胞膜孔隙;隨后電壓下降減少對細(xì)胞的損傷。缺點可能是對細(xì)胞電阻、緩沖液、電極間隙等敏感,需要優(yōu)化。
方波脈沖在設(shè)定時間內(nèi)電壓基本保持恒定,然后結(jié)束??稍O(shè)定脈沖時間、脈沖數(shù)、脈沖間隔、脈沖電壓。適合某些敏感細(xì)胞類型、難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞等。
優(yōu)點在于電壓恒定,刺激更為“可控”;缺點是可能對某些系統(tǒng)(如電阻變化大的樣品)更加要求嚴(yán)格。
下面列出在實驗中應(yīng)重點調(diào)整或監(jiān)控的參數(shù),并解釋其在電穿孔過程中的物理/生物意義。
這是施加于樣品兩電極之間的電勢差。GenePulser Xcell 可輸出范圍較廣,根據(jù)型號及模塊不同可達(dá)高達(dá)約 3000 V。
較高電壓有利于形成更多或更大的細(xì)胞膜孔隙,從而提高轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化效率。但電壓過高可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡、氣體放電或電弧事故。使用時應(yīng)結(jié)合電極間隙(cuvette gap)與樣本體積、電阻情況進(jìn)行合理選擇。
對于指數(shù)衰減模式,用戶可設(shè)定電容,或時間常數(shù)(τ=R×C,在工具給定或可測情況下)。電容越大,充電后釋放的能量越大;相應(yīng)地,時間常數(shù)也越長,電壓下降越緩慢。GenePulser Xcell 在低壓、高電容回路中支持從 25 μF 到 3,275 μF 的范圍(在 CE 模塊情況下) 。
在高電壓回路(例如 500–3,000 V)下,其可設(shè)電容一般為 10、25、50 μF。
通過設(shè)置適當(dāng)電容/時間常數(shù),可以調(diào)控電擊的“寬度”——電壓維持高水平的時間越長,對細(xì)胞穿孔效應(yīng)越大,但可能損傷也越嚴(yán)重。
在系統(tǒng)中,并聯(lián)電阻(Parallel Resistance)用于控制負(fù)載;樣本實際電阻也需要滿足一定條件。GenePulser Xcell 的 PC 模塊可提供 50–1,000 Ω(50 Ω步進(jìn))并聯(lián)電阻。
樣品電阻最低要求:當(dāng)輸出 10–2,500 V 時,樣品電阻至少約 20 Ω;當(dāng)輸出 2,500–3,000 V 時,樣品電阻至少約 600 Ω。
樣品電阻過低可能導(dǎo)致電流過大、擊穿或電弧;過高可能導(dǎo)致電壓下降快、穿孔效率低。因此在實驗前測定樣本電阻很重要。
對于方波模式,GenePulser Xcell 在 10–500 V 區(qū)間可設(shè)定脈沖時間從 0.05 到 100 ms(0.05 ms 步進(jìn))并可進(jìn)行 1-10 脈沖,脈沖間隔為 0.1-10 秒。
在高壓范圍 500-3,000 V 下,則脈沖時間一般為 0.05-5 ms,脈沖數(shù)為1-2次,間隔為至少 5-30 秒。
這些參數(shù)決定了每次電擊的“刺激長短”和“次數(shù)”,直接影響穿孔效率與細(xì)胞存活率。一般來說,多次脈沖或延長脈沖時間可以提高轉(zhuǎn)染率,但也可能降低存活率。
GenePulser Xcell 系統(tǒng)兼容 0.1 cm、0.2 cm 和 0.4 cm 間隙的比色皿。
電極間隙越小,相同電壓下電場強度越高(E=V/d),容易穿孔但也更易損傷。因此,通常細(xì)菌、酵母用小間隙(0.1–0.2 cm),哺乳動物細(xì)胞用較大間隙如 0.4 cm。樣本體積(如 100 μL)和細(xì)胞濃度也需要配合間隙、電壓進(jìn)行優(yōu)化。
以下為典型操作流程(手動模式為例),可按需改為使用預(yù)設(shè)或用戶自定義模式。
將儀器及模塊正確連接:關(guān)閉主機電源,連接 CE 模塊/PC 模塊(任選一或兩者視系統(tǒng)配置),以及 ShockPod 電擊腔。
插入所選比色皿(電極間隙根據(jù)實驗設(shè)定選擇),將待電穿孔樣本(細(xì)胞 + 質(zhì)粒/試劑)加入比色皿中,并放入 ShockPod。確保安全蓋關(guān)閉。
打開儀器,進(jìn)入主菜單。選擇模式:
手動操作(Manual)
預(yù)設(shè)程序(Pre-set Protocol)
用戶程序(User Protocol)
若為手動模式:選擇波形(指數(shù)衰減或方波)→ 輸入相關(guān)參數(shù)(如電壓、電容/時間常數(shù)、電阻/樣本電阻、脈沖時間、脈沖數(shù)、間隔、比色皿縫隙、樣本體積)→ 確認(rèn)后,Pulse 按鈕變?yōu)榭砂礌顟B(tài)。
按 Pulse 按鈕實施電擊。儀器顯示 “Pulsing”,電擊結(jié)束后發(fā)出提示音,并顯示結(jié)果(如實際電壓、電流、時間常數(shù)等) 。
若有需要,可按 Back 鍵返回參數(shù)界面,調(diào)整或重復(fù)操作。
建議記錄每次參數(shù)及結(jié)果,便于后續(xù)優(yōu)化或故障排查。該系統(tǒng)可存儲最近 100 次脈沖數(shù)據(jù)。
以下為儀器出廠預(yù)設(shè)程序中摘錄部分常用細(xì)胞類型的參數(shù),以供參考。使用時仍推薦依據(jù)細(xì)胞類型/緩沖條件自行優(yōu)化。
| 細(xì)胞類型 | 波形 | 脈沖時間(msec) | 電容(μF) | 比色皿間隙 (cm) | 電壓 (V) |
|---|---|---|---|---|---|
| CHO (哺乳動物) | 方波 | 15 | — | 0.2 | 100 |
| COS7 | 方波 | 20 | — | 0.2 | 100 |
| 3T3 | 指數(shù)衰減 | — | 160 | 0.2 | 100 |
| E. coli (細(xì)菌) | 指數(shù)衰減 | 25 | 200 | 0.1 | 1800 |
| S. cerevisiae (酵母) | 指數(shù)衰減 | 25 | 200 | 0.4 | 80 (μl) |
(注:以上表格為示范,實際操作時仍建議查閱最新儀器手冊,并結(jié)合細(xì)胞類型、緩沖體系、比色皿間隙、電阻情況進(jìn)行優(yōu)化。)
對于新細(xì)胞系或?qū)嶒炂脚_,建議先從儀器預(yù)設(shè)程序入手。
測量樣品電阻(儀器具備測電阻功能)。如果電阻偏離典型值(如過低或過高),應(yīng)調(diào)整樣本濃度、緩沖體系或比色皿縫隙。
選擇比色皿間隙適配電壓與細(xì)胞類型:小間隙提高電場強度,適合細(xì)菌、酵母;大間隙適合哺乳動物、敏感系。
若使用方波模式,建議從較短脈沖時間、較低電壓開始,觀察存活率,再逐步提升以尋找最佳轉(zhuǎn)染率/存活率平衡。
若使用指數(shù)衰減模式,可先用標(biāo)準(zhǔn)電容/電壓組合,再微調(diào)電容或時間常數(shù)以改變電壓下降曲線。
電壓:逐步提升電壓,注意細(xì)胞死亡率和電弧情況。適度提升電壓可提高穿孔率。
電容/時間常數(shù):若細(xì)胞存活率過低,可嘗試減小電容或縮短時間常數(shù);若轉(zhuǎn)染效率低,可適度增大。
脈沖數(shù)與間隔:單次脈沖更適合易轉(zhuǎn)細(xì)胞;對于難轉(zhuǎn)細(xì)胞,多脈沖可嘗試,但要保證細(xì)胞有足夠恢復(fù)時間(間隔)。
樣本體積或濃度:樣本濃度過高可能導(dǎo)致電場分布不均、電阻下降,樣本濃度過低則可能降低效率。
比色皿間隙:如電場效果不佳,可考慮換間隙(例如從 0.4 cm 換為 0.2 cm,但相應(yīng)地需降低電壓以避免過強電場)。
緩沖體系、溫度、離子強度:這些外圍因素雖非儀器“參數(shù)”,也會顯著影響結(jié)果。建議使用專用電穿孔緩沖液、保持樣本冷卻(通常在 4 °C操作或立即轉(zhuǎn)入回溫培養(yǎng))。
每次電擊后注意檢查實際脈沖參數(shù)(如實際電壓、時間常數(shù)、是否出現(xiàn)電?。鹎闆r)儀器界面會顯示。
同時評估:轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化效率、細(xì)胞存活率、重復(fù)性情況。
若轉(zhuǎn)化效率低,但存活率高,說明穿孔可能不足,可提高強度;反之若存活率低而效率卻高,可能強度過大或電場不均。
建議記錄每次實驗參數(shù)、樣本特性及結(jié)果,以便建立經(jīng)驗庫或回溯優(yōu)化路徑。GenePulser Xcell 支持存儲最近100次脈沖記錄。
電弧/跳火:通常因為電壓過高、電極臟污、電極間隙不當(dāng)或樣品中氣泡。建議清潔電極、更換比色皿、降低電壓、排除氣泡。
細(xì)胞死亡率高但轉(zhuǎn)染率低:可能電場過強或脈沖時間過長。嘗試降低電壓、減少脈沖數(shù)或縮短脈沖時間。
轉(zhuǎn)染率低且細(xì)胞存活率高:說明穿孔不充分。可適當(dāng)提高電壓或延長脈沖時間/增大電容。
重復(fù)性差:可能樣品電阻變化大、緩沖液差異大、比色皿間隙不一致、溫度波動、或電極污染。需保持條件一致,及時校準(zhǔn)/更換配件,并記錄詳細(xì)操作流程。
不同細(xì)胞類型切換時效果差異大:建議為每個細(xì)胞類型建立專屬于該類型的優(yōu)化流程(用戶程序模式)。避免直接用細(xì)菌參數(shù)套用于哺乳動物細(xì)胞。
使用 GenePulser Xcell 獲取良好的電穿孔/轉(zhuǎn)染結(jié)果,關(guān)鍵在于:理解并合理設(shè)置電壓、電容/時間常數(shù)、電阻、脈沖時間、脈沖數(shù)、間隔及比色皿縫隙;配合細(xì)胞類型、緩沖液、樣本電阻等因素;對參數(shù)體系進(jìn)行系統(tǒng)且記錄化優(yōu)化。通過預(yù)設(shè)程序快速啟動實驗,再通過手動模式精細(xì)調(diào)優(yōu),可以提高效率與成功率。正確操作、仔細(xì)記錄與系統(tǒng)優(yōu)化相結(jié)合,才能充分發(fā)揮該系統(tǒng)的功能。
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