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伯樂（Bio-Rad）Gene Pulser Xcell 電穿孔儀是一種高精度、可控性強(qiáng)的基因?qū)朐O(shè)備，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、細(xì)胞工程及生物制藥等研究領(lǐng)域。其核心技術(shù)是利用短時(shí)高電場脈沖在細(xì)胞膜上形成可逆性納米孔，使外源核酸、蛋白質(zhì)或其他帶電分子穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)或細(xì)胞核。
在整個(gè)電穿孔實(shí)驗(yàn)中，樣品制備是決定實(shí)驗(yàn)成功率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。合理的細(xì)胞處理、緩沖體系選擇、外源物質(zhì)純度控制以及溫度與離子濃度的調(diào)節(jié)，均直接影響電穿孔效率和細(xì)胞存活率。
本文將系統(tǒng)介紹Gene Pulser Xcell 電穿孔儀在不同實(shí)驗(yàn)體系中的樣品制備方法與參數(shù)要求，涵蓋細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及植物原生質(zhì)體等典型樣本類型，為研究者提供標(biāo)準(zhǔn)化的前處理方案與操作指導(dǎo)。
樣品純凈：樣品中不得含有鹽分、蛋白雜質(zhì)或顆粒物，否則容易引發(fā)電弧放電，損傷細(xì)胞及設(shè)備。
細(xì)胞狀態(tài)良好：處于生長旺盛期的健康細(xì)胞對(duì)電穿孔反應(yīng)最佳。衰老或死亡細(xì)胞膜穩(wěn)定性差，易破裂。
低離子強(qiáng)度緩沖液：選擇低電導(dǎo)率的電穿孔緩沖體系以減少電解效應(yīng)。
溫度控制：操作過程中維持低溫（4°C）可降低熱積累，提高細(xì)胞生存率。
樣品體積與濃度適中：保證電極間液體充滿但不過量，防止氣泡生成。
這些原則適用于所有類型的電穿孔實(shí)驗(yàn)，是確保數(shù)據(jù)可重復(fù)性與結(jié)果穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。
選取新鮮菌株，接種于液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（OD600≈0.5–0.7）。
過度培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁增厚、通透性降低，影響穿孔效率。
將菌液以4°C、5000 rpm離心5分鐘，棄上清。
用無離子滅菌水或低離子緩沖液（如10%甘油溶液）洗滌3–4次。
每次洗滌后輕輕重懸，直至電導(dǎo)率降至10 μS/cm以下。
最后一次離心后將細(xì)胞重懸于10%甘油溶液中，濃度約為10? cells/mL。
樣品可直接用于電穿孔，或在–80°C短期保存。
使用高純度質(zhì)粒（A260/A280比值1.8–2.0），濃度建議為10 ng/μL。
溶液應(yīng)無鹽、無乙醇?xì)埩?，否則會(huì)導(dǎo)致電弧。
在無菌冰上混合細(xì)胞與DNA溶液，典型體積比例為：
細(xì)胞：50 μL
DNA溶液：1–2 μL
混合后立即裝入0.1 cm電極杯中進(jìn)行電擊。
此法適用于大腸桿菌、沙門氏菌等常見原核模型。
選擇活性強(qiáng)的酵母菌株，接種于YPD培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至中期（OD600≈0.8）。
細(xì)胞壁較厚的酵母需進(jìn)行軟化預(yù)處理。
使用1 M山梨醇溶液作為滲透保護(hù)劑。
可加入少量β-葡聚糖酶或Zymolyase輕度酶解以提高膜通透性。
離心（3000 rpm，5分鐘）后用冰冷山梨醇緩沖液洗滌3次。
將細(xì)胞重懸于1 M山梨醇緩沖液中，濃度為1–2 × 10? cells/mL。
若樣品過稠，可適當(dāng)稀釋。
DNA純度需高于90%，量約為2–5 μg。
混合后輕輕吹勻，避免劇烈振蕩造成細(xì)胞破裂。
樣品溫度應(yīng)保持在冰上4°C；
確保電極杯干燥，無氣泡；
使用0.2 cm或0.4 cm電極杯，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇電壓（一般250–500 V）。
常用細(xì)胞系包括HeLa、CHO、293T、Jurkat等。
細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長期，無污染，活性≥95%。
貼壁細(xì)胞需用0.25%胰酶消化后離心收集。
懸浮細(xì)胞直接離心（1000 rpm，5分鐘）。
使用無鈣無鎂PBS或?qū)Ｓ秒姶┛拙彌_液洗滌兩次，以去除培養(yǎng)基鹽分。
典型組成：
10 mM HEPES（pH 7.2）
250 mM 蔗糖
1 mM MgCl?
0.1 mM CaCl?
該體系電導(dǎo)率低，可有效減少電解反應(yīng)。
調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10?–1×10? cells/mL。
加入高純度質(zhì)粒DNA（10–20 μg/mL）或mRNA（1–5 μg/mL）。
對(duì)蛋白質(zhì)或復(fù)合體導(dǎo)入，可適當(dāng)降低濃度以減輕負(fù)荷。
將300 μL樣品轉(zhuǎn)入0.4 cm電極杯，輕輕拍打去除氣泡。
使用方波模式（250 V、10 ms×2次）效果最佳。
電擊后立即加入1 mL預(yù)溫培養(yǎng)基中，37°C孵育1小時(shí)進(jìn)行修復(fù)。
取新鮮葉片或懸浮細(xì)胞，切成細(xì)條后置于酶解液（含纖維素酶與果膠酶）中。
25°C輕輕震蕩3–5小時(shí)，直至形成懸浮單細(xì)胞。
通過濾網(wǎng)去除雜質(zhì)，低速離心收集原生質(zhì)體。
用0.4 M甘露醇溶液洗滌3次以去除酶液殘留。
重懸于含Ca2?的滲透緩沖液中（例如0.4 M甘露醇 + 10 mM CaCl? + 10 mM MES，pH 5.7）。
推薦使用高純度質(zhì)粒DNA 10–30 μg/mL。
混合后輕輕倒置數(shù)次，避免泡沫。
電極杯間距0.4 cm，體積約300 μL。
設(shè)置200 V、30 ms方波單脈沖。
電擊后立即轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)液中，25°C避光培養(yǎng)6–8小時(shí)。
需使用RNase-free條件操作，所有溶液應(yīng)經(jīng)DEPC處理。
RNA溶解于無鹽緩沖液中（例如1 mM HEPES，pH 7.0）。
冷凍保存前避免反復(fù)凍融。
蛋白應(yīng)處于單體狀態(tài)，避免聚集。
溶液pH應(yīng)接近生理值（6.8–7.4）。
若含金屬離子或鹽分，應(yīng)通過透析去除。
這些高分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的難度較大，需在方波模式下延長脈沖時(shí)間或增加脈沖次數(shù)。
| 緩沖液類型 | 主要成分 | 應(yīng)用對(duì)象 |
|---|---|---|
| 10% 甘油溶液 | 甘油+去離子水 | 細(xì)菌 |
| 山梨醇緩沖液 | 1 M 山梨醇 + 10 mM CaCl? | 酵母 |
| 低離子HEPES緩沖液 | 10 mM HEPES + 250 mM 蔗糖 | 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 |
| 甘露醇溶液 | 0.4 M 甘露醇 + 10 mM MES | 植物原生質(zhì)體 |
所有緩沖液在使用前應(yīng)經(jīng)0.22 μm濾膜過濾滅菌，并在4°C保存不超過1周。
理想電導(dǎo)率應(yīng)低于50 μS/cm；
超過該值會(huì)導(dǎo)致電弧或加熱現(xiàn)象。
pH值應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相近，以減少電場刺激；
滲透壓控制在250–400 mOsm/kg，防止細(xì)胞脹裂或脫水。
所有電穿孔操作應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行，避免高溫導(dǎo)致電流不均或膜不可逆損傷；
樣品制備后應(yīng)立即使用；
若需暫存，可置于4°C短期保存（≤24小時(shí)），避免反復(fù)凍融。
確保電極杯干凈、干燥，防止導(dǎo)電殘留。
樣品體積適配電極間距，推薦：
0.1 cm杯：50–100 μL
0.2 cm杯：200 μL
0.4 cm杯：400 μL
去除所有氣泡，可輕輕敲擊杯壁。
裝樣后立即電擊，避免長時(shí)間暴露。
在電穿孔前后均需檢測樣品質(zhì)量：
顯微鏡觀察：判斷細(xì)胞完整性與形態(tài)。
臺(tái)盼藍(lán)染色：評(píng)估存活率。
電導(dǎo)率檢測：確認(rèn)緩沖液純度。
DNA/RNA濃度測定：保證導(dǎo)入劑量一致。
若細(xì)胞損傷嚴(yán)重，應(yīng)重新調(diào)整緩沖體系或降低能量參數(shù)。
Cas9 mRNA 與 sgRNA 需在無離子環(huán)境下混合，比例1:1。
樣品應(yīng)預(yù)冷，避免RNA降解。
T細(xì)胞、B細(xì)胞需在激活48小時(shí)后進(jìn)行電穿孔。
使用專用低鈉離子緩沖體系，保證細(xì)胞活性。
對(duì)蛋白-DNA復(fù)合體、脂質(zhì)顆粒等樣品，應(yīng)調(diào)整電場至中等能量并延長脈沖。
| 問題 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 電弧或爆裂 | 緩沖液含鹽過高、氣泡未除 | 使用低離子緩沖液，輕拍去泡 |
| 導(dǎo)入率低 | DNA濃度不足或細(xì)胞狀態(tài)差 | 提高DNA量或更換新鮮培養(yǎng) |
| 細(xì)胞死亡率高 | 電壓過高或樣品升溫 | 降低電壓，預(yù)冷樣品 |
| 樣品重復(fù)性差 | 洗滌不徹底或電極污染 | 嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化洗滌步驟 |
| 無表達(dá) | 質(zhì)粒損壞或載體不兼容 | 檢查DNA質(zhì)量，優(yōu)化載體系統(tǒng) |
標(biāo)準(zhǔn)化操作：制定統(tǒng)一制備流程，減少人為誤差。
批次記錄：詳細(xì)記錄細(xì)胞來源、緩沖液批號(hào)、DNA純度。
環(huán)境監(jiān)控：保持無菌、低離子、低溫條件。
結(jié)果追蹤：通過轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率評(píng)估制備質(zhì)量。
在Gene Pulser Xcell電穿孔實(shí)驗(yàn)中，樣品制備決定了實(shí)驗(yàn)的成敗。
高質(zhì)量的細(xì)胞、低電導(dǎo)率的緩沖體系、合理的溫度控制和精確的體積操作，能顯著提高轉(zhuǎn)化效率并延長設(shè)備壽命。
科學(xué)的樣品制備應(yīng)具備三大特點(diǎn)：
標(biāo)準(zhǔn)化：操作規(guī)范、參數(shù)可重復(fù)；
精準(zhǔn)化：濃度、電導(dǎo)率、溫度控制在最佳范圍；
兼容性：不同細(xì)胞類型對(duì)應(yīng)差異化制備策略。
通過嚴(yán)格遵循樣品制備原則，研究人員能夠充分發(fā)揮伯樂Gene Pulser Xcell電穿孔儀的性能，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、高效、安全的電穿孔實(shí)驗(yàn)效果。
杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
