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伯樂(lè)（Bio-Rad）電穿孔儀165-2660是一款廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、基因工程及細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的高性能設(shè)備。其核心原理是利用瞬時(shí)高壓脈沖在細(xì)胞膜上形成可逆性孔道，使外源DNA、RNA或蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)基因?qū)牖蚍肿愚D(zhuǎn)化。
設(shè)備以高穩(wěn)定性、高重復(fù)性和多功能控制著稱，適用于細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體及其他真核體系。為了確保實(shí)驗(yàn)的成功率與數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程尤為重要。本文將系統(tǒng)介紹165-2660電穿孔儀的實(shí)驗(yàn)步驟，從設(shè)備準(zhǔn)備到實(shí)驗(yàn)后處理，全面闡述每個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵細(xì)節(jié)與操作要點(diǎn)。
在每次實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)對(duì)電穿孔儀進(jìn)行全面檢查，確保設(shè)備處于最佳工作狀態(tài)：
檢查電源是否穩(wěn)定（建議220V ±10%）；
確認(rèn)儀器顯示屏正常、按鍵靈敏；
確保電極槽清潔無(wú)鹽分或殘留液體；
檢查電轉(zhuǎn)杯與接觸點(diǎn)是否完好無(wú)裂痕；
打開(kāi)電源后，觀察自檢提示是否正常顯示“Ready”。
若發(fā)現(xiàn)任何異常（如“Check Cuvette”“Arc Detected”等提示），應(yīng)暫停實(shí)驗(yàn)并重新確認(rèn)連接狀態(tài)。
實(shí)驗(yàn)應(yīng)在潔凈、干燥、無(wú)電磁干擾的環(huán)境下進(jìn)行；
操作者需佩戴防護(hù)手套與護(hù)目鏡；
禁止在設(shè)備帶電狀態(tài)下更換電轉(zhuǎn)杯；
儀器使用后應(yīng)自動(dòng)放電30秒后再進(jìn)行維護(hù)。
電穿孔的核心是細(xì)胞樣品的質(zhì)量。不同細(xì)胞類型對(duì)電壓與環(huán)境條件的要求不同。通用準(zhǔn)備原則如下：
細(xì)菌樣品：培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600≈0.6），用10%甘油洗滌3次，保持低導(dǎo)電性。
酵母樣品：提前進(jìn)行酶解或滲透緩沖液預(yù)處理，去除細(xì)胞壁部分成分。
哺乳細(xì)胞：保持高活性、無(wú)鈣鎂離子環(huán)境，懸浮于等滲無(wú)鹽緩沖液。
植物原生質(zhì)體：確保酶解完全，懸浮于含0.5 M甘露醇緩沖液中以維持滲透壓。
樣品溫度應(yīng)保持在4°C左右，避免過(guò)熱導(dǎo)致膜損傷。
核酸純度：A260/A280比值1.8–2.0；
濃度：10–100 ng/μL；
溶劑：無(wú)鹽Tris或超純水；
無(wú)任何乙醇、鹽或酚殘留。
根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適電壓范圍：
| 樣品類型 | 推薦電壓范圍 | 電轉(zhuǎn)杯間隙 | 電場(chǎng)強(qiáng)度(kV/cm) |
|---|---|---|---|
| 大腸桿菌 | 2.3–2.5 kV | 0.2 cm | 11–12.5 |
| 酵母 | 1.0–1.5 kV | 0.2 cm | 5–7.5 |
| 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 | 0.25–0.8 kV | 0.4 cm | 0.6–2 |
| 植物原生質(zhì)體 | 0.6–1.0 kV | 0.4 cm | 1.5–2.5 |
在設(shè)備前面板上旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)旋鈕或通過(guò)數(shù)字輸入鍵設(shè)定所需值。
165-2660配備多檔電容系統(tǒng)（25 μF–3300 μF），實(shí)驗(yàn)者可依據(jù)所需能量選擇合適電容。電容越高，脈沖持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)。
時(shí)間常數(shù)τ = R × C，一般理想值如下：
細(xì)菌：4–5 ms；
酵母：6–8 ms；
哺乳細(xì)胞：8–10 ms；
植物原生質(zhì)體：10–12 ms。
設(shè)定完成后，按下“Ready”鍵確認(rèn)系統(tǒng)進(jìn)入待機(jī)狀態(tài)。
165-2660可輸出單脈沖或多脈沖信號(hào)。
單脈沖：用于細(xì)菌與酵母；
多脈沖：用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
間隔可設(shè)定為50–500 ms，建議默認(rèn)100 ms以防熱積累。
取50–100 μL細(xì)胞懸液于無(wú)菌離心管中，加入1–5 μL高純DNA溶液。輕輕吹打混勻，不可劇烈震蕩。
混合液保持在冰上備用，以減少電轉(zhuǎn)前溫升。
選擇合適間隙的電轉(zhuǎn)杯（0.1、0.2或0.4 cm），確保干燥潔凈。
若杯體剛清洗完，應(yīng)完全晾干；
用移液器吸取混合樣品注入電轉(zhuǎn)杯中，液體應(yīng)覆蓋電極并無(wú)氣泡；
若出現(xiàn)氣泡，可輕敲杯壁排除。
將電轉(zhuǎn)杯放入儀器電極槽內(nèi)，確保接觸緊密。
合上安全蓋后，顯示屏應(yīng)自動(dòng)提示“Ready”。此時(shí)系統(tǒng)進(jìn)入待命狀態(tài)。
按下“Pulse”或“Start”鍵，儀器輸出瞬時(shí)高壓脈沖。整個(gè)放電過(guò)程僅持續(xù)數(shù)毫秒。
結(jié)束后屏幕會(huì)顯示：
實(shí)際電壓（kV）；
放電時(shí)間常數(shù)（ms）；
脈沖曲線狀態(tài)。
若出現(xiàn)“ARC DETECTED”提示，說(shuō)明發(fā)生電弧，應(yīng)檢查緩沖液鹽分或樣品氣泡。
放電完成后，立即用無(wú)菌移液器吸出樣品，轉(zhuǎn)入預(yù)先準(zhǔn)備的復(fù)蘇培養(yǎng)基中。
復(fù)蘇條件：
細(xì)菌：37°C搖床復(fù)蘇45–60分鐘；
酵母：30°C靜置復(fù)蘇1小時(shí)；
哺乳細(xì)胞：37°C培養(yǎng)2–4小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基；
植物原生質(zhì)體：在等滲液中靜置12小時(shí)以上恢復(fù)。
復(fù)蘇后的細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行培養(yǎng)或篩選：
對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的樣品，可在含抗生素平板上涂布；
對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可進(jìn)行熒光檢測(cè)或抗性篩選；
對(duì)植物樣品，可觀察再生能力及轉(zhuǎn)化率。
記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)：電壓、電容、脈沖次數(shù)、時(shí)間常數(shù)、樣品體積、溫度等。
165-2660可自動(dòng)保存最近1000次放電數(shù)據(jù)，便于結(jié)果追蹤與參數(shù)優(yōu)化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷開(kāi)電源并等待自動(dòng)放電結(jié)束。
使用無(wú)離子水沖洗電轉(zhuǎn)杯與電極槽，必要時(shí)可用70%乙醇消毒。
徹底晾干后保存，防止殘留離子腐蝕。
電壓過(guò)低會(huì)導(dǎo)致穿孔不足，轉(zhuǎn)化率低；電壓過(guò)高則細(xì)胞死亡率高。應(yīng)在初次實(shí)驗(yàn)時(shí)使用較低電壓起始，逐步增加以確定最佳條件。
一般電壓與電容匹配規(guī)則：
細(xì)菌：2.5 kV / 25 μF；
酵母：1.5 kV / 50 μF；
哺乳細(xì)胞：0.45 kV / 250 μF；
植物原生質(zhì)體：0.8 kV / 1000 μF。
任何氣泡都會(huì)形成局部高電阻，導(dǎo)致電弧放電。
操作時(shí)應(yīng)緩慢注液；
電轉(zhuǎn)杯應(yīng)預(yù)冷；
樣品導(dǎo)電性控制在理想范圍（4–6 μS/cm）。
高溫會(huì)加速細(xì)胞膜破裂。所有樣品及杯體應(yīng)預(yù)冷至4°C，放電后立即進(jìn)行復(fù)蘇。
復(fù)蘇時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜修復(fù)不完全。對(duì)于不同體系應(yīng)根據(jù)膜修復(fù)特性合理延長(zhǎng)。
| 問(wèn)題 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 出現(xiàn)電弧放電 | 緩沖液導(dǎo)電性高或樣品中有氣泡 | 重新洗滌樣品，排氣泡，更換緩沖液 |
| 時(shí)間常數(shù)異常低 | 樣品電阻過(guò)小或電容設(shè)置錯(cuò)誤 | 檢查緩沖液成分，調(diào)整電容 |
| 轉(zhuǎn)化效率低 | 電壓過(guò)低、DNA濃度不足 | 提高電壓或DNA濃度 |
| 樣品過(guò)熱 | 連續(xù)放電間隔過(guò)短 | 延長(zhǎng)間隔或降低電容 |
| 無(wú)放電反應(yīng) | 電轉(zhuǎn)杯未接觸良好 | 重新插入電轉(zhuǎn)杯或清潔電極 |
理想時(shí)間常數(shù)表明放電均勻。若τ過(guò)低，說(shuō)明電流過(guò)快，能量未充分作用；若τ過(guò)高，則樣品電阻過(guò)大，需更換緩沖液或降低細(xì)胞密度。
轉(zhuǎn)化效率 = 陽(yáng)性克隆數(shù) / 投入DNA量（μg）。
通過(guò)對(duì)比不同電壓與電容組合下的效率，可獲得最優(yōu)電穿孔參數(shù)。
通過(guò)復(fù)蘇后細(xì)胞計(jì)數(shù)或顯微鏡觀察判斷。若死亡率高于50%，需降低能量參數(shù)或縮短脈沖。
放電后等待30秒再取出電轉(zhuǎn)杯，防止殘余電荷；
禁止在安全蓋打開(kāi)時(shí)啟動(dòng)放電；
定期檢查電極接觸點(diǎn)有無(wú)腐蝕或變形；
每3–6個(gè)月進(jìn)行電壓輸出校準(zhǔn)；
存放設(shè)備時(shí)應(yīng)斷電并覆蓋防塵罩。
電轉(zhuǎn)杯：0.2 cm
電壓：2.5 kV
電容：25 μF
樣品體積：80 μL
放電時(shí)間常數(shù)：4.9 ms
結(jié)果：轉(zhuǎn)化效率1×10? CFU/μg DNA。
電轉(zhuǎn)杯：0.4 cm
電壓：0.45 kV
電容：250 μF
脈沖數(shù)：2次，間隔100 ms
放電時(shí)間常數(shù)：8.5 ms
結(jié)果：蛋白表達(dá)效率80%，細(xì)胞活性保持70%。
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