伯樂電穿孔儀 165-2661 是一款針對基因?qū)搿⒌鞍踪|(zhì)遞送、RNA 轉(zhuǎn)染與藥物電穿孔等應(yīng)用而設(shè)計的高精度儀器。
要獲得高轉(zhuǎn)化效率與良好細胞存活率,必須在操作前充分了解樣品要求。樣品條件直接影響電場分布、電導(dǎo)特性及膜孔形成,因此樣品準備的規(guī)范化是確保實驗成功的關(guān)鍵。
本指南全面介紹不同類型樣品(細菌、酵母、動物細胞、植物原生質(zhì)體及特殊體系)在電穿孔前的準備標準,幫助研究者科學(xué)設(shè)定實驗條件。
樣品中不得含有任何鹽離子、培養(yǎng)基殘留或高導(dǎo)電雜質(zhì)。
若使用含鹽溶液(如 PBS、LB、DMEM 等),會在放電瞬間產(chǎn)生電弧,導(dǎo)致樣品炭化或細胞死亡。
推薦使用低離子緩沖液或無離子水系統(tǒng)溶液,如 1 mM HEPES 或 無離子 Tris。
理想電導(dǎo)率:0.5–1.5 mS/cm。
電導(dǎo)率過高 → 電弧風(fēng)險增加、時間常數(shù)下降;
電導(dǎo)率過低 → 電場分布不均,能量釋放不充分。
可使用電導(dǎo)儀檢測樣品電導(dǎo)率并調(diào)整緩沖液比例。
樣品必須為單細胞懸液。聚集或沉降會造成局部電場過強。
建議使用輕柔吹打或短時間低速離心重懸;
不可劇烈震蕩,以免造成細胞膜破裂。
所有樣品在放電前需預(yù)冷至 4℃。
低溫可:
降低熱積累;
提高細胞膜修復(fù)能力;
穩(wěn)定電阻與時間常數(shù)。
放電后立即轉(zhuǎn)入預(yù)溫 37℃ 培養(yǎng)基恢復(fù)細胞狀態(tài)。
電擊杯中加入樣品體積不超過總?cè)莘e 80%。
0.1 cm 杯:40–50 μL;
0.2 cm 杯:60–80 μL;
0.4 cm 杯:400–800 μL。
細胞濃度建議:
| 體系 | 推薦濃度 | 備注 |
|---|---|---|
| 細菌 | 1 × 10? cells/mL | 洗滌 2–3 次去鹽 |
| 酵母 | 1 × 10? cells/mL | 稀釋后冰上保存 |
| 動物細胞 | 1 × 10?–1 × 10? cells/mL | 使用無血清培養(yǎng)液 |
| 植物原生質(zhì)體 | 1 × 10? cells/mL | 過濾除去碎片 |
1. 生理狀態(tài)
應(yīng)選取對數(shù)生長期細胞( OD??? ≈ 0.5–0.7 ),此時期膜結(jié)構(gòu)最具可逆性。
2. 洗滌步驟
取培養(yǎng)液 10 mL, 4℃ 離心 4000 rpm × 5 min;
棄上清,用 無離子 水或 10% 甘油洗滌 3 次;
最終重懸于 1 mM HEPES 或 10% 甘油中。
3. DNA 加入量
推薦 1–10 ng 高純度質(zhì)粒;過量 DNA 可能影響電場均勻。
4. 典型電壓區(qū)間
1800–2500 V (0.2 cm 電極間隙)。
1. 細胞培養(yǎng)
取對數(shù)期 Saccharomyces cerevisiae 培養(yǎng)物( OD??? ≈ 1.0 )。
2. 預(yù)處理
洗滌 3 次 → 去除培養(yǎng)基鹽分;
重懸于 1 M 山梨醇 緩沖液(維持滲透壓);
冰上靜置 10 min。
3. DNA 添加量
100–500 ng 高純度質(zhì)粒 DNA。
4. 推薦條件
電壓 1400–1600 V,電場 6–8 kV/cm,時間常數(shù) 6–8 ms。
1. 細胞狀態(tài)
細胞應(yīng)處于 80% 融合或懸浮生長對數(shù)期,避免凋亡或高密度狀態(tài)。
2. 培養(yǎng)條件
使用無血清培養(yǎng)液或 Opti-MEM 稀釋;
不可含 NaCl > 20 mM;
細胞經(jīng) PBS 兩次洗滌后重懸于低導(dǎo)緩沖液。
3. DNA/RNA 或蛋白質(zhì)添加
每 0.4 mL 樣品加入 1–2 μg 質(zhì)?;?mRNA。
4. 推薦電壓
400–700 V (0.4 cm 間距,方波模式),時間常數(shù) 6–8 ms。
5. 復(fù)蘇要求
電擊后立即轉(zhuǎn)入 37℃ 含血清培養(yǎng)基恢復(fù) 1–2 小時。
1. 原生質(zhì)體提取
從新鮮葉片中經(jīng)酶解獲得單細胞懸液。
2. 洗滌
用 0.4 M 甘露醇溶液洗滌 2 次以維持滲透平衡。
3. DNA 用量
5–10 μg 純化質(zhì)粒 DNA。
4. 推薦條件
電壓 600–800 V,電場 1.5–2 kV/cm,方波模式,時間常數(shù) 8–9 ms。
5. 特別注意
原生質(zhì)體對剪切力極敏感,操作需輕柔,禁止震蕩。
電場強度 4–7 kV/cm;
需預(yù)冷 + 甘油保護;
DNA 濃度 50–200 ng/樣。
溶劑必須無離子且 pH 7.0 ± 0.2;
顆粒均勻分散,避免團聚;
體積 ≤ 0.5 mL。
如 T 細胞、NK 細胞等免疫體系:
使用專用電穿孔緩沖液(低鈉、無血清);
電壓 200–400 V,多脈沖模式。
| 類型 | 組成 | 適用體系 |
|---|---|---|
| 低離子 HEPES 緩沖液 | 1 mM HEPES pH 7.2 | 細菌、酵母 |
| 甘油緩沖液 | 10% 甘油 + 1 mM Tris | 微生物與藻類 |
| 山梨醇緩沖液 | 1 M 山梨醇 + 1 mM CaCl? 微量 | 酵母、真菌 |
| 低鹽 Opti-MEM | 1:1 稀釋 | 動物細胞 |
| 甘露醇溶液 | 0.4 M 甘露醇 | 植物原生質(zhì)體 |
維持在 6.8–7.4 之間。酸堿偏差會影響膜穩(wěn)定性和離子遷移。
所有緩沖液需 4℃ 保存,不得使用陳舊或受污染溶液。使用前恢復(fù)至室溫以避免電導(dǎo)率突變。
純度 ≥ 1.8 (A???/A???);
無蛋白、無鹽;
線性化或超螺旋形式均可。
純度 ≥ 2.0;
使用 DEPC 水溶解;
防止反復(fù)凍融。
緩沖液離子強度低;
濃度 < 1 mg/mL;
避免含 Tris-HCl > 20 mM 或鹽。
分散體系透明無沉淀;
顆粒直徑 < 200 nm;
溶劑需無機鹽 < 1 mM。
| 現(xiàn)象 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 電弧閃光 | 樣品含鹽、氣泡或?qū)щ娦愿?/span> | 更換低鹽緩沖液、排除氣泡 |
| 時間常數(shù)過短 | 電導(dǎo)率過高 | 稀釋樣品或降電壓 |
| 無轉(zhuǎn)化效果 | 電場不足或 DNA 濃度低 | 提高電壓或增加 DNA 量 |
| 細胞死亡率高 | 電壓過高或溫度過高 | 預(yù)冷樣品、降低電壓 |
| 電擊后樣品混濁 | 膜破裂 | 檢查緩沖液 pH 與溫度 |
短期保存:冰上保存 ≤ 1 小時;
長期保存:離心后棄上清,細胞重懸于 10% 甘油,–80℃ 凍存;
運輸要求:使用干冰運輸,避免溫度波動。
DNA、RNA 等外源分子需獨立低溫保存,防止降解。
在電穿孔前應(yīng)進行以下檢測:
細胞活性檢測:用 Trypan Blue 染色,活性 > 95% 方可使用。
電導(dǎo)率檢測:用便攜式電導(dǎo)儀,確保在 0.5–1.5 mS/cm 之間。
體積確認:注入電擊杯前檢查氣泡并控制在安全容積。
樣品均勻性:顯微鏡下應(yīng)無明顯團塊。
| 樣品類型 | 電場強度 (kV/cm) | 濃度 (cells/mL) | 外源分子量 | 溫度 | 緩沖液 |
|---|---|---|---|---|---|
| 細菌 | 9–12 | 1×10? | DNA 1–10 ng | 4℃ | 1 mM HEPES |
| 酵母 | 6–8 | 1×10? | DNA 100 ng | 4℃ | 1 M 山梨醇 |
| CHO 細胞 | 1.5–2 | 1×10? | DNA 2 μg | 4℃ | Opti-MEM |
| 植物原生質(zhì)體 | 1.5–2 | 1×10? | DNA 5–10 μg | 4℃ | 0.4 M 甘露醇 |
| 藻類 | 4–7 | 1×10? | RNA 200 ng | 4℃ | 10% 甘油 |
所有樣品均應(yīng)在 BSL-2 或等同條件下操作;
處理人體細胞或臨床樣品時需使用獨立電擊杯;
放電前確認蓋鎖閉合并佩戴絕緣手套;
實驗臺保持干燥、防止液體外溢;
廢棄樣品經(jīng)高壓滅菌后棄置。
樣品無鹽、無氣泡;
電導(dǎo)率檢測合格;
體積適配電擊杯;
外源分子純度合格;
電極與杯體干燥;
ShockPod 蓋鎖正常;
參數(shù)設(shè)定匹配樣品類型。
減少鹽離子殘留:離心后用低離子緩沖液反復(fù)洗滌;
提高膜穩(wěn)定性:添加 甘油 5–10% 作為保護劑;
提升導(dǎo)入率:保持對數(shù)期細胞活性;
避免熱積累:每次放電間隔 ≥ 10 秒;
使用新鮮樣品:避免冷凍反復(fù)融化造成膜損傷。
| 樣品條件 | 影響表現(xiàn) |
|---|---|
| 電導(dǎo)率偏高 | 電弧、時間常數(shù)短、細胞損傷 |
| 電導(dǎo)率偏低 | 能量不足、導(dǎo)入率低 |
| 細胞聚集 | 電場不均、穿孔率不穩(wěn)定 |
| 溫度過高 | 細胞死亡、DNA 降解 |
| 緩沖液 pH 偏差 | 電流異常、膜孔不閉合 |
| DNA 純度不足 | 導(dǎo)入后表達率下降 |
因此,樣品質(zhì)量控制是確保數(shù)據(jù)可重復(fù)性的基礎(chǔ)。
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