伯樂電穿孔儀 165-2661 是基于高壓脈沖原理實(shí)現(xiàn)外源分子導(dǎo)入細(xì)胞的一體化設(shè)備,具有電壓精準(zhǔn)、時(shí)間常數(shù)可控、能量輸出穩(wěn)定和數(shù)據(jù)可追溯等優(yōu)點(diǎn)。
然而,電穿孔實(shí)驗(yàn)的成功并不僅取決于設(shè)備本身,還受到樣品狀態(tài)、緩沖體系、電場強(qiáng)度、脈沖模式、溫度控制等多因素影響。
通過系統(tǒng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,可以有效提高轉(zhuǎn)化效率、細(xì)胞存活率和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。本指南以 165-2661 儀器為核心,從參數(shù)調(diào)節(jié)、體系選擇、能量控制、波形設(shè)計(jì)到環(huán)境管理等多方面,闡述可行的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化策略。
實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的核心在于找到電能輸入與細(xì)胞耐受性的平衡點(diǎn)。
電場過強(qiáng)或時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜永久破裂;反之,能量不足則無法形成有效孔道。
165-2661 的優(yōu)化原則包括:
精確控制電場強(qiáng)度 — 依據(jù)細(xì)胞尺寸與類型選擇合適電壓。
優(yōu)化放電時(shí)間常數(shù) — 使電場持續(xù)時(shí)間足夠形成瞬時(shí)孔道但不損傷細(xì)胞。
降低樣品導(dǎo)電性 — 減少電弧與熱效應(yīng)。
溫度預(yù)處理 — 通過冷卻減輕熱損傷。
標(biāo)準(zhǔn)化操作 — 確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性與可比較性。
電穿孔的關(guān)鍵參數(shù)是電場強(qiáng)度 E=V/dE = V / dE=V/d,其中:
EEE:電場強(qiáng)度 (kV/cm)
VVV:施加電壓 (V)
ddd:電極間距 (cm)
通常,電場強(qiáng)度在 5–25 kV/cm 范圍內(nèi)可形成可逆孔。
| 體系類型 | 電極間距 (cm) | 推薦電壓 (V) | 電場強(qiáng)度 (kV/cm) | 
|---|---|---|---|
| E. coli | 0.2 | 1800–2500 | 9–12.5 | 
| 酵母 | 0.2 | 1200–1600 | 6–8 | 
| 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 | 0.4 | 400–800 | 1–2 | 
| 植物原生質(zhì)體 | 0.4 | 600–900 | 1.5–2.2 | 
先以中等電壓進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn);
在 10% 電壓梯度下遞增測試,評估存活率與轉(zhuǎn)化率;
若電弧頻發(fā),說明電壓過高或樣品含鹽;
以轉(zhuǎn)化效率最高且細(xì)胞完整率 ≥ 70% 的電壓為最佳值。
時(shí)間常數(shù) τ=R×C\tau = R \times Cτ=R×C,反映電場衰減速度。
τ 過短 → 孔道形成不足,導(dǎo)入效率低;
τ 過長 → 熱積累增加,細(xì)胞損傷嚴(yán)重。
| 體系 | 電容 (μF) | 時(shí)間常數(shù) τ (ms) | 特征 | 
|---|---|---|---|
| E. coli | 25 | 4–5 | 高效短脈沖 | 
| 酵母 | 500 | 6–8 | 中等脈沖 | 
| 動(dòng)物細(xì)胞 | 800–1000 | 7–9 | 需緩和電場 | 
| 原生質(zhì)體 | 1000 | 8–10 | 穩(wěn)定持續(xù)放電 | 
保持電壓固定,逐步增加電容;
測量 τ 值并記錄細(xì)胞存活率;
選取 τ = 5–8 ms 區(qū)間內(nèi)最優(yōu)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)條件;
若 τ 偏離目標(biāo),可調(diào)整樣品電導(dǎo)率或電阻匹配模式。
鹽離子濃度高會(huì)引發(fā)電弧放電并降低穿孔均勻性。
推薦使用以下低導(dǎo)電緩沖體系:
10% 甘露醇溶液;
1 mM HEPES + 250 mM 蔗糖;
去離子水 + 10% 甘油。
pH 維持在 7.0–7.5;
導(dǎo)電率 < 1.5 mS/cm;
若離子濃度偏高,可通過稀釋或透析處理。
緩沖液預(yù)冷至 4 ℃;
每次實(shí)驗(yàn)使用新配制溶液;
過濾除菌,防止顆粒引起局部放電。
溫度直接影響細(xì)胞膜流動(dòng)性與孔道修復(fù)速度。
將樣品、電擊杯及 ShockPod 一同冷卻至 0–4 ℃;
有助于減少電場產(chǎn)生的熱效應(yīng)。
電擊結(jié)束后立即轉(zhuǎn)入 25–37 ℃ 的恢復(fù)培養(yǎng)基;
靜置 30–60 分鐘,有利于膜修復(fù)與表達(dá)啟動(dòng)。
低溫僅用于電擊前,不可延長時(shí)間以免細(xì)胞代謝下降;
動(dòng)物細(xì)胞可在 4 ℃ 下處理,恢復(fù)階段必須在溫控培養(yǎng)箱內(nèi)完成。
165-2661 提供兩種主要放電波形:指數(shù)衰減波(Exponential Decay)與方波(Square Wave)。
適用于細(xì)菌、酵母、真菌等堅(jiān)韌細(xì)胞;
優(yōu)點(diǎn):能量集中、短時(shí)間完成電穿孔;
τ 越短,電場衰減越快,損傷較小。
適合動(dòng)物細(xì)胞和原生質(zhì)體等敏感體系;
優(yōu)點(diǎn):電場持續(xù)穩(wěn)定,孔徑均一;
通常采用 2–3 次脈沖,每次持續(xù) 1–5 ms。
| 波形 | 適用體系 | 參數(shù)調(diào)整方向 | 
|---|---|---|
| 指數(shù)波 | 原核、酵母 | 調(diào)整 τ 長短以控制能量 | 
| 方波 | 動(dòng)物、植物細(xì)胞 | 優(yōu)化脈沖時(shí)間與間隔 | 
實(shí)驗(yàn)可通過切換模式比較存活率與導(dǎo)入效率。
樣品體積建議為電擊杯容量的 70–80%;
過多液體易導(dǎo)致電場不均或電??;
過少液體則電阻增大,放電不充分。
| 體系 | 最佳濃度 (cells/mL) | 
|---|---|
| E. coli | 1×10? | 
| 酵母 | 1×10? | 
| 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 | 1×10? | 
| 原生質(zhì)體 | 5×10?–10? | 
濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間電連接增加,導(dǎo)致局部放電;過低則影響分子導(dǎo)入概率。
質(zhì)粒 DNA:0.1–5 μg / 每 100 μL 樣品;
siRNA / mRNA:10–100 nM;
過量核酸可能引發(fā)凝集或?qū)щ娦陨摺?/span>
適用于細(xì)菌與酵母,能量集中、操作簡便。
動(dòng)物細(xì)胞及植物原生質(zhì)體常采用 2–3 次脈沖。
間隔時(shí)間設(shè)置 0.5–2 秒,使細(xì)胞有足夠時(shí)間部分恢復(fù)。
若連續(xù)放電導(dǎo)致溫度上升,可適當(dāng)延長間隔;
觀察轉(zhuǎn)化率變化,確定脈沖次數(shù)對效率提升的臨界點(diǎn)。
在電擊結(jié)束后 10 秒內(nèi),將樣品轉(zhuǎn)入適溫恢復(fù)培養(yǎng)基。
| 體系 | 恢復(fù)培養(yǎng)條件 | 時(shí)間 | 
|---|---|---|
| E. coli | SOC 培養(yǎng)基 37 ℃ | 45–60 分鐘 | 
| 酵母 | YPD 培養(yǎng)基 30 ℃ | 1 小時(shí) | 
| 動(dòng)物細(xì)胞 | 完全培養(yǎng)基 37 ℃、5% CO? | 2 小時(shí) | 
| 原生質(zhì)體 | 含甘露醇溶液 25 ℃ | 1–1.5 小時(shí) | 
恢復(fù)階段不可振蕩過劇,以免細(xì)胞裂解;
添加適量抗氧化劑(如谷胱甘肽)可提高活性。
165-2661 自動(dòng)記錄放電曲線。
τ 值穩(wěn)定在 ±0.1 ms 以內(nèi)表明系統(tǒng)運(yùn)行良好;
若 τ 異常波動(dòng),需檢查電極接觸或樣品電導(dǎo)率。
理想能量釋放率 ≥ 90%;若偏低說明電容未完全放電或存在內(nèi)部損耗。
以陽性克隆數(shù)、熒光信號或蛋白表達(dá)量評估成功率;
建立數(shù)據(jù)表格,將不同參數(shù)下的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化比較。
同一實(shí)驗(yàn)體系保持樣品體積、電極間距和緩沖液成分一致;
每次操作使用相同批次電擊杯與緩沖液;
記錄放電溫度與時(shí)間常數(shù),分析穩(wěn)定性;
若偏差超過 5%,需重新校準(zhǔn)電壓與電容模塊。
嚴(yán)格控制樣品電導(dǎo)率 ≤ 1.5 mS/cm;
排除氣泡,液體完全覆蓋電極;
使用新電擊杯,避免老化裂紋;
樣品和電擊槽保持干燥;
連續(xù)操作時(shí)每 10 次放電后暫停 2 分鐘散熱。
初始條件:2000 V,25 μF,0.2 cm 電擊杯;
τ = 4.8 ms,成功率 92%;
將電壓提高至 2300 V 后,轉(zhuǎn)化效率提升至 97%,但存活率下降 10%;
結(jié)論:維持 2000 V 為最佳。
初始條件:600 V,800 μF,方波 2 次;
轉(zhuǎn)染率 70%,存活率 85%;
調(diào)整至 650 V,脈沖 3 次,間隔 1 秒,效率升至 80%,存活率仍達(dá) 83%。
條件:0.4 cm 電極間距,700 V,1000 μF;
調(diào)整 τ 從 8.5 ms → 7.5 ms 后,表達(dá)水平提高 30%;
標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化五步法:
預(yù)實(shí)驗(yàn):確定初始參數(shù)組合(電壓、電容、波形)。
單因素調(diào)整:每次只變動(dòng)一個(gè)變量,記錄結(jié)果。
數(shù)據(jù)記錄與擬合:分析效率、存活率與 τ 的相關(guān)性。
模型建立:確定最優(yōu)能量區(qū)間與電場范圍。
方案固化:保存為 Preset Protocol,實(shí)現(xiàn)快速調(diào)用。
每 3 個(gè)月校驗(yàn)電壓輸出與時(shí)間常數(shù);
若偏差 >2%,重新校正高壓模塊。
清潔觸點(diǎn),保持金屬亮面;
檢查蓋鎖靈敏度,防止誤觸發(fā)。
165-2661 支持固件升級,可優(yōu)化參數(shù)算法與數(shù)據(jù)記錄精度。
實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn) “三維平衡”:
| 維度 | 含義 | 優(yōu)化方向 | 
|---|---|---|
| 能量控制 | 電壓、電容、時(shí)間常數(shù) | 精準(zhǔn)可控,防止過載 | 
| 生物響應(yīng) | 細(xì)胞存活率、轉(zhuǎn)化效率 | 在能量與存活間取得平衡 | 
| 操作可重復(fù)性 | 參數(shù)一致性與環(huán)境穩(wěn)定 | 建立標(biāo)準(zhǔn)化SOP | 
當(dāng)三者均達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí),實(shí)驗(yàn)性能即處于最佳區(qū)間。
          
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